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前言

抗體-小分子藥物偶聯(lián)物（antibody drug conjugates, ADCs）, 是治療性生物制品的一類，可通過抗體精準(zhǔn)識(shí)別靶向細(xì)胞，通過內(nèi)吞作用進(jìn)入靶向細(xì)胞后釋放出偶聯(lián)的小分子藥物，從而實(shí)現(xiàn)對靶向細(xì)胞精準(zhǔn)殺滅的目的，并減少對于正常細(xì)胞的殺傷。由于ADC的設(shè)計(jì)原理，自2000年第一個(gè)ADC 藥物Mylotarg® (gemtuzumab ozogamicin) 被 FDA 批準(zhǔn)后[1], 截止2025年6月，已經(jīng)有19個(gè)ADC被批準(zhǔn)上市。自2023年全球ADC銷售總額第一次突破百億美元后，2024年全球ADC銷售總額繼續(xù)超過百億美元，持續(xù)了強(qiáng)勁的增長勢頭。 

該藥物于2013年被FDA批準(zhǔn)上市，用于HER2陽性乳腺癌的治療，2024年全球銷售額約為23億美元[2]。恩美曲妥珠單抗是一種靶向 HER2 的ADC，含有人源化抗-HER2 IgG1 曲妥珠單抗，該抗體通過穩(wěn)定的硫醚連接體 MCC（4-[N-馬來酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-羧酸酯）與微管抑制藥物 DM1（美坦辛衍生物）共價(jià)結(jié)合，分子量分布范圍在147~158kDa, 其藥物/單抗偶聯(lián)比（drug to antibody ratio, DAR）分布為0~8，平均DAR約為3.5 [3]。由于其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，對其進(jìn)行表征就顯得頗具挑戰(zhàn)性。在本文的研究中，我們使用今年美國質(zhì)譜年會(huì)（ASMS）上剛剛發(fā)布的新一代二合一超高分辨質(zhì)譜儀Excedion Pro Biopharma 對KADCYLA進(jìn)行了全面的表征，證明了該平臺(tái)在生物制藥領(lǐng)域中出色的分析能力，尤其是電子轉(zhuǎn)移解離輔助高能碰撞碎裂（electron-transfer/higher-energy collision dissociation， EThcD）功能，有助于精準(zhǔn)鑒定藥物偶聯(lián)位點(diǎn)，以及翻譯后修飾（Post-translational modification, PTM）的鑒定。

應(yīng)用亮點(diǎn)

如前文所述，今年新發(fā)布的新一代二合一超高分辨質(zhì)譜儀Excedion Pro Biopharma被用于KADCYLA的深入表征。該儀器的亮點(diǎn)包括但不僅限于拓展至m/z=12,000 Da的質(zhì)量檢測范圍 （需配置BioPharma option），能夠滿足在非變性條件下對單克隆抗體單體/二聚體/三聚體，以及其他大分子量蛋白復(fù)合物進(jìn)行分子量測定；選配的ETD功能，可以實(shí)現(xiàn)快速靈敏的ETD/EThcD碎裂，與高能碰撞碎裂（Higher-energy Collisional Dissociation, HCD）聯(lián)合使用，能夠獲得全面豐富的蛋白序列覆蓋度以及PTM鑒定信息。Excedion Pro Biopharma儀器結(jié)構(gòu)如圖1所示，圖2展示了本次實(shí)驗(yàn)中KADCYLA深入表征的流程。 

圖1. Excedion Pro BioPharma結(jié)構(gòu)圖，相較于前代產(chǎn)品的硬件更新部分在圖上以藍(lán)色高亮標(biāo)明。選配BioPharma Edition可以將質(zhì)量檢測范圍拓展至m/z=12,000 Da (綠色方框部分)，選配ETD可以實(shí)現(xiàn)ETD/EThcD碎裂（紅色方框部分）。（點(diǎn)擊查看大圖）

圖2. KADCYLA表征流程圖。

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非變性條件下KADCYLA完整分子量測定

完整分子量測定是生物醫(yī)藥類產(chǎn)品表征中的一項(xiàng)，對于ADC而言，除完整分子量外，平均DAR值和藥物負(fù)載分布 （drug load distribution, DLD）也是評判藥物質(zhì)量的關(guān)鍵屬性。在本實(shí)驗(yàn)中，我們在非變性條件下對KADCYLA進(jìn)行完整分子量測定。非變性條件使用中性緩沖鹽體系，與變性條件相比，蛋白分子更接近其天然狀態(tài)，且非變性條件下蛋白帶電更少，相鄰電荷態(tài)之間的質(zhì)譜峰重疊更少，能夠減少質(zhì)譜信號(hào)之間的互相干擾，有助于得到更準(zhǔn)確的完整分子量測定結(jié)果。圖3展示了KADCYLA非變性條件下完整分子量測定的結(jié)果。為了使樣品更接近天然狀態(tài)，我們并未對其進(jìn)行脫糖處理。由圖3A可見，在原始譜圖層面，偶聯(lián)了不同數(shù)目藥物和不同糖型組分的質(zhì)譜峰基本實(shí)現(xiàn)基線分離，經(jīng)解卷積后可清晰的觀察到0~8的藥物偶聯(lián)分布（圖3B），BioPharma Finder軟件可自動(dòng)計(jì)算平均DAR值，該ADC的平均DAR值為3.47 （圖3C），與文獻(xiàn)報(bào)道的3.5一致。

（A）

（B）

（C）

圖3. 非變性條件下KADCYLA完整分子量測定結(jié)果。 A, 原始譜圖及局部放大圖。B, 解卷積譜圖。C，BioPharma Finder軟件能夠自動(dòng)選取相關(guān)組分并計(jì)算平均DAR值。（點(diǎn)擊查看大圖）

數(shù)據(jù)依賴性的EThcD二級碎裂用于肽圖分析，

實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)位點(diǎn)定位以及PTM鑒定

基于液質(zhì)聯(lián)用的肽圖分析是生物治療型產(chǎn)品表征中的常用分析方法之一，可實(shí)現(xiàn)序列覆蓋度、各種化學(xué)修飾位點(diǎn)定位以及常見翻譯后修飾的定性定量分析等。在各種質(zhì)譜碎裂技術(shù)中，由于HCD碎裂能夠?qū)㈦逆I打斷后產(chǎn)生豐富的b/y碎片離子用于肽段鑒定，故其被廣泛應(yīng)用于肽圖分析中。然而，對于一些修飾肽段，例如糖肽、連接子-藥物偶聯(lián)肽段等，由于HCD會(huì)將糖鏈/連接子-藥物偶聯(lián)打碎，所以對于有多個(gè)潛在修飾位點(diǎn)的肽段，使用HCD碎裂無法精確定位修飾位點(diǎn)；另外，對于一些含有異構(gòu)化氨基酸的肽段，例如亮氨酸/異亮氨酸、天冬氨酸/天冬氨酸異構(gòu)化等，由于HCD產(chǎn)生的b/y離子質(zhì)量相同，故無法對其進(jìn)行區(qū)分。而ETD因?yàn)榉磻?yīng)機(jī)理不同，既可以在碎裂肽段骨架的同時(shí)完整保留糖鏈、連接子-藥物偶聯(lián)等側(cè)鏈修飾，對于異構(gòu)化氨基酸，也可以產(chǎn)生特征性的診斷離子，從而實(shí)現(xiàn)異構(gòu)化氨基酸的鑒定和區(qū)分。在ETD碎裂的基礎(chǔ)上添加HCD輔助碎裂，即EThcD，可以在同一張二級譜圖中同時(shí)得到b/y及c/z離子，得到更加全面豐富的信息實(shí)現(xiàn)肽段，尤其是修飾/異構(gòu)化肽段的表征。Excedion Pro 二合一超高分辨質(zhì)譜儀配備ETD選項(xiàng)后，可實(shí)現(xiàn)快速、靈敏的ETD/ETchD碎裂，可以設(shè)置數(shù)據(jù)依賴性的EThcD二級碎裂（data dependent EThcD MS2, dd EThcD MS2）數(shù)據(jù)采集模式，與數(shù)據(jù)依賴性的HCD二級碎裂（dd HCD MS2）形成互補(bǔ)，以獲得肽圖分析信息。

在本文的研究中，我們分別使用Trypsin和AspN兩種蛋白酶對KADCYLA進(jìn)行了變性酶解，隨后對于兩種不同蛋白酶酶解的樣品，均進(jìn)行了dd HCD MS2 以及 dd EThcD MS2數(shù)據(jù)采集，以獲得序列覆蓋度、偶聯(lián)位點(diǎn)分布和翻譯后修飾等信息。使用dd HCD MS2，Trypsin和AspN酶解的樣品均可實(shí)現(xiàn)一針進(jìn)樣100%序列覆蓋度（數(shù)據(jù)未展示）。圖4展示了使用dd EThcD MS2, Trypsin和AspN酶解的樣品肽圖分析的基峰譜圖（Base Peak Chromatogram, BPC）以及序列覆蓋圖，同樣可以達(dá)到一針進(jìn)樣100%序列覆蓋度，證明了Excedion Pro 二合一超高分辨質(zhì)譜儀的ETD/ETchD碎裂可與常規(guī)流速液相色譜兼容，獲得高質(zhì)量的二級譜圖用于肽圖分析。 

圖4. KADCYLA肽圖分析基峰譜圖和序列覆蓋度，均為dd ETchD MS2數(shù)據(jù)采集模式。左，Trypsin酶解樣品。右，AspN酶解樣品。 對于不同蛋白酶酶解樣品，均可實(shí)現(xiàn)單針進(jìn)樣100%序列覆蓋。（點(diǎn)擊查看大圖）

如前文所述，KADCYLA的連接子-藥物（MCC-DM1）是通過共價(jià)結(jié)合方式偶聯(lián)在賴氨酸上的，曲妥珠單抗的N末端也會(huì)發(fā)生偶聯(lián)，故對于整個(gè)KADCYLA分子而言，潛在的偶聯(lián)位點(diǎn)共有92個(gè)，其中不重復(fù)的位點(diǎn)有46個(gè)（圖5）。由于賴氨酸被共價(jià)偶聯(lián)后會(huì)產(chǎn)生空間位阻，導(dǎo)致trypsin漏切，所以trypsin酶解會(huì)產(chǎn)生包含多個(gè)賴氨酸的連接子-藥物偶聯(lián)肽段，而HCD碎裂會(huì)同時(shí)打碎肽段骨架和偶聯(lián)藥物，導(dǎo)致無法僅憑HCD二級譜圖準(zhǔn)確判斷藥物偶聯(lián)位點(diǎn)。而EThcD由于碎裂機(jī)理不同，可以在碎裂肽段骨架的同時(shí)保留藥物偶聯(lián)基團(tuán)，優(yōu)化后的HCD輔助碎裂能量可以使肽段碎裂更充分，同時(shí)保留完整偶聯(lián)的藥物。表1展示了分別使用HCD和EThcD對Trypsin酶解樣品進(jìn)行二級碎裂，獲得的藥物偶聯(lián)位點(diǎn)信息匯總，46個(gè)潛在修飾位點(diǎn)中，鑒定到了43個(gè)存在藥物修飾，可見使用EThcD碎裂，對于含有多個(gè)潛在偶聯(lián)位點(diǎn)的肽段，可以準(zhǔn)確定位偶聯(lián)位置，與HCD結(jié)果結(jié)合，可以獲得全面詳實(shí)的偶聯(lián)位點(diǎn)信息。

圖5. KADCYLA分子全部潛在修飾位點(diǎn)，以紅色方框在蛋白序列中標(biāo)出，總共92個(gè)位點(diǎn)，其中不重復(fù)的有46個(gè)位點(diǎn)。

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表1. KADCYLA鑒定位點(diǎn)匯總

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紅色字體，偶聯(lián)位點(diǎn)。“++”, 偶聯(lián)位點(diǎn)可通過二級碎片離子確認(rèn)。 “+”, 該肽段上存在偶聯(lián)，但無法通過碎片離子確認(rèn)具體偶聯(lián)位置?！?”, 未鑒定到偶聯(lián)。

使用AspN對KADCYLA進(jìn)行酶解時(shí)，重鏈會(huì)產(chǎn)生一條含有三個(gè)賴氨酸的肽段DK(216)K(217)VEPK(221)SC，且通過trypsin酶解樣品的肽圖分析結(jié)果可知，這三個(gè)賴氨酸均有被偶聯(lián)的可能。KADCYLA的MCC-DM1連接子-藥物含有一個(gè)異構(gòu)中心（圖6，左上），導(dǎo)致藥物偶聯(lián)肽段在反相色譜上均會(huì)以對峰的形式被洗脫。如圖6所示，由于多個(gè)潛在偶聯(lián)位點(diǎn)和MCC-DM1異構(gòu)化中心的存在，肽段DK(216)K(217)VEPK(221)SC的提取離子流圖（Extract ion current, XIC）呈現(xiàn)多組對峰。得益于EThcD碎裂產(chǎn)生的信息豐富的二級譜圖，可以準(zhǔn)確鑒定不同保留時(shí)間洗脫的肽段是哪一個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了偶聯(lián)（圖6，下），并且可以根據(jù)XIC峰面積計(jì)算每種修飾的相對比例（圖6，右上）。

圖6. 通過EThcD對含有多個(gè)偶聯(lián)位點(diǎn)的肽段進(jìn)行偶聯(lián)位點(diǎn)鑒定。（點(diǎn)擊查看大圖）

對于ADC樣品，除藥物偶聯(lián)位點(diǎn)外，與藥品質(zhì)量相關(guān)的各種翻譯后修飾也需要表征和監(jiān)控。圖7展示了基于EThcD二級碎裂譜圖，對肽段FNWYVisoD(283)GVEVHNAK的天冬氨酸異構(gòu)化的鑒定結(jié)果。得益于儀器平臺(tái)的高靈敏度和高質(zhì)量精度，即使相對含量只有未修飾肽段0.18%的異構(gòu)化肽段，仍然可以鑒定到豐富的c/z離子，還有天冬氨酸異構(gòu)化在ETD碎裂中產(chǎn)生的特征性c+57/z-57離子，從而實(shí)現(xiàn)天冬氨酸異構(gòu)化的確證。對于其他常見的翻譯后修飾，如脫酰胺、氧化和糖基化等，均可得到相對定量結(jié)果（圖8）。

圖7. 使用EThcD碎裂確認(rèn)天冬氨酸異構(gòu)化。下方局部放大圖可觀察到c+57/z-57離子。（點(diǎn)擊查看大圖）

圖8. 其他常見翻譯后修飾相對定量結(jié)果，所有結(jié)果均為三針dd ETchD MS2重復(fù)進(jìn)樣平均值。A, 甲硫氨酸氧化。B, 天冬酰胺脫酰胺。C, 天冬酰胺琥珀酰亞胺化。D, 色氨酸氧化。E, 重鏈N-糖基化。（點(diǎn)擊查看大圖）