您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)
產(chǎn)品分類品牌分類
-
混勻儀|混合器 氣體發(fā)生器 分光測色計 勻漿機(jī) 研磨機(jī) 超凈工作臺 洗板機(jī) 高低溫試驗箱 恒溫金屬浴 電阻爐 溶劑過濾器 漩渦混合儀|旋渦混勻儀 均質(zhì)器 水槽 恒溫水槽 手套 培養(yǎng)板 生物安全柜 天平 滴定管 瓶口分液器 光澤儀 錐入度儀 濁度計 分析儀 冷藏保存箱 色差儀 超純水機(jī) 預(yù)制冷槽 油浴槽 冷卻水循環(huán)裝置 溶媒回收裝置 恒溫水浴槽 液氮罐 馬弗爐 酶標(biāo)儀 培養(yǎng)箱 電泳儀 潔凈工作臺 干燥箱 磁力攪拌器 滅菌器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 低溫冰箱 防爆冰箱 離心機(jī) 振蕩器 移液器 真空泵
實時熒光定量PCRReal-time PCR 工作原理
閱讀：2165 發(fā)布時間：2021-3-28
理論基礎(chǔ)
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)作為一種革命性的方法在生物學(xué)研究的歷史中占據(jù)了重要的地位。以此為基礎(chǔ)發(fā)展出包括real-time PCR在內(nèi)的多項應(yīng)用技術(shù)。自誕生后real-time PCR技術(shù)持續(xù)發(fā)展，從簡單的增擴(kuò)到整個PCR過程，real-time PCR表現(xiàn)出比PCR更敏感、更明確的定量分析特性和對識別等位基因的能力。
不少人以為real-time就是意味著可以在顯示器上看到每個循環(huán)增擴(kuò)曲線的增長。事實并非如此，早期的軟件不能在運(yùn)行期間提供可視化的增擴(kuò)曲線。主要是因為SDS軟件采用整個平臺最終的數(shù)據(jù)執(zhí)行數(shù)據(jù)分析工作，而不是分析每個單獨(dú)的反應(yīng)循環(huán)。對某些設(shè)備來說，必須向分析軟件提供實時的最終的數(shù)據(jù)，有些設(shè)備則不需要。前一種設(shè)備允許軟件實時跟蹤每個加樣口的增擴(kuò)曲線，同時顯示在電腦屏幕上。Real-time PCR其實是一種real-time設(shè)備。
RNA定量分析依靠逆轉(zhuǎn)錄酶制作cDNA（complementary DNA）。常見的逆轉(zhuǎn)錄酶有2種，AMV和MMLV。AMV是一種鳥類myeloblastosis病毒的二聚體蛋白質(zhì)，MMLV來自于鼠科leukemia病毒的monomeric蛋白。2種酶都有RNase把RNA變性為RNA-DNA雜交體的活性，比較而言AMV有更高的RNase H活性。RNase H活性和依賴于RNA的DNA聚合酶活性能被mutagenesis區(qū)分開來。更重要的是每個AMV能把較多的分子聚攏在一起，推動增擴(kuò)反應(yīng)的進(jìn)行。原生的AMV有高于MMLV的適用溫度，42?C對37?C。修改后的變種可以有更高的溫度極限，分別是AMV58?C，MMLV55?C。
按照以上的描述，大家可能認(rèn)為改造后的AMV是適宜從RNA制作cDNA的酶。然而，在實際使用中經(jīng)改造的MMLV工作的較好。其中的原因目前仍不明，猜測高溫破壞了2種酶的聚合酶活性，但殘留的DNA綁定活性對Taq polymerase形成物理障礙。二聚體構(gòu)象和較高的溫度極限也許使得AMV表現(xiàn)不佳。出于這個原因應(yīng)在實驗中盡可能少的使用逆轉(zhuǎn)錄酶。需要強(qiáng)調(diào)的是即使沒有引物cDNA仍然能被逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制造出來，RNA模板的二級結(jié)構(gòu)可能自我引發(fā)反應(yīng)。有3種方法可以準(zhǔn)備逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：oligo-dT，random primers or assay-specific primers。其中oligo-dT的使用較廣泛，它使用mRNAs作為模板。但是不是所有mRNA都有poly-A尾，最大的問題是oligo-dT把增擴(kuò)區(qū)域限制在了mRNA poly-A 尾的附近。當(dāng)轉(zhuǎn)錄較長的片段時（<500bp）反應(yīng)開始于3’ UTR。這樣的結(jié)果有高的忠實性，也意味著增擴(kuò)出的序列可能不會跨過一個外顯子連接。對于有些實驗，3’ UTR富含不利于PCR實驗的A/T堿基。因此使用自由引物制造轉(zhuǎn)錄序列放棄3’ UTR，但自由引物也同時會制造核糖體和transfer RNAs的cDNA，出現(xiàn)大量且復(fù)雜的cDNA。第三種方法是使用針對每個實驗的引物（assay-specific primers），理論上講這種引物滿足轉(zhuǎn)錄目標(biāo)序列的要求，得到相應(yīng)的cDNA產(chǎn)物。
Real-time PCR反應(yīng)增擴(kuò)子的最大長度大約在250 bases，從前面的討論可知assay-specific primers是大多數(shù)實驗較佳的選擇。但是assay-specific primers有2個明顯的缺點(diǎn)，每次PCR反應(yīng)使用較多的RNA樣本，不能用于一臺儀器上同時處理幾種樣本的反應(yīng)。注意根據(jù)實驗需要合理的選擇引物，安排實驗計劃。
現(xiàn)代PCR反應(yīng)的核心是耐熱DNA聚合酶，常用的是Thermus aquaticus也稱Taq。野生型Taq是依賴DNA從5->3合成的，具有3->5校對功能的聚合酶，它也有5’-nuclease的活性。Real-time PCR常用變異后移除校對功能的品種。市場上有2種版本的Taq，修改后的Taq和熱啟動（hot start）Taq。
現(xiàn)今市場上的real-time PCR設(shè)備均使用熒光劑作為信號源，熒光的強(qiáng)度隨著增擴(kuò)產(chǎn)物的增加而成比例的增長。熒光劑分子吸收光線中狹小波長的光子，能被染料吸收的光線叫做激發(fā)波長。激發(fā)后的分子處于較高的能量狀態(tài)，持續(xù)時間很短，分子迅速衰退到原先的狀態(tài)。在這個過程中一個光子以較長的波長發(fā)散出來，對于每一個熒光染料都有一個優(yōu)化的激發(fā)和發(fā)散波長。在狹窄的優(yōu)化波長范圍內(nèi)，熒光分子能被激發(fā)或檢測到。熒光實驗主要要求在最初和最后的10個PCR循環(huán)中信號強(qiáng)度有盡可能大的差異。熒光劑染料分子（donor或reporter）由外部的優(yōu)化波長光線激活后，釋放出較長波的光線去激活臨近的另一個分子（acceptor），這樣的過程稱為三角洲。接受光線的分子可能會也可能不會釋放出光線。每一次的轉(zhuǎn)發(fā)過程都會使波長有所增加，直至real-time設(shè)備能接收到。Real-time PCR的熒光劑按照功能區(qū)分有3個類型，1. Donor發(fā)散出的熒光信號在實驗過程中被檢測到。2. Acceptor負(fù)責(zé)冷卻Donor發(fā)出的信號。3. 是參照染料，參照染料不與其他成分產(chǎn)生反應(yīng)，軟件用它校正不同加樣孔的信號。理論上講，熒光劑染料可以成為reporter。常見的染料有6-FAM (6-carboxy fluorescein)和YBR® Green I，前一種能被由氬離子激光制造的488 nm的波長激發(fā)。6-FAM容易和寡核苷酸結(jié)合釋放出一個強(qiáng)信號。YBR® Green I與6-FAM不同，是一種自由染料。
冷卻分子可以是熒光染料也可以是其他能吸收恰當(dāng)波長的光線能量的分子，原來和6-FAM一起使用的是TAMRA (6-carboxy-tetramethylrhodamine)。FAM在靠近TAMAR的位置上有效地吸收光子能量。除此之外，不發(fā)光的黑色染料也可用于reporter。常見的有DABSYL (4-(dimethylamino)azobenzene-4’-sulfonyl chloride)。參照組的熒光信號比較每個加樣孔的不同，保證每個加樣孔的信號在整體上較平穩(wěn)。設(shè)備上的不同會形成加樣孔之間數(shù)值的偏差，叫做“邊緣效應(yīng)”，要求對每個加樣孔的數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化。但是當(dāng)邊緣效應(yīng)過大，內(nèi)側(cè)加樣孔和外側(cè)加樣孔的差距過大就不再適合參照組作為標(biāo)準(zhǔn)化的依據(jù)。常見的參照染料是ROX (6-carboxy-X-rhodamine)