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蛋白質(zhì)印跡是研究實(shí)驗(yàn)室普遍使用的一種技術(shù)，用于研究感興趣的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)印跡用于抗體驗(yàn)證、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究以及許多其他應(yīng)用。1然而，生成可解釋的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果可能具有挑戰(zhàn)性。以下是一些常見(jiàn)問(wèn)題以及解決方法。
高背景
| 可能是由于 | 嘗試這個(gè) |
|---|---|
| 高抗體濃度 | 使用一抗和二抗進(jìn)行滴定。包括已知的蛋白質(zhì)對(duì)照。 |
| 封閉液 | 使用新鮮的封閉液，增加封閉時(shí)間/溫度，嘗試不同的封閉劑。 |
| 印跡在封閉/洗滌過(guò)程中干燥 | 確保膜在封閉和清洗步驟中被充分覆蓋。 |
| 洗得不夠 | 增加洗滌次數(shù)和洗滌液體積。確保至少洗滌 3 次，每次 5 分鐘。 |
| 膠片曝光過(guò)度 | 嘗試較短的曝光時(shí)間。 |
沒(méi)信號(hào)
| 可能是由于 | 嘗試這個(gè) |
|---|---|
| 抗體濃度太低 | 使用一抗和二抗進(jìn)行滴定。包括已知的蛋白質(zhì)對(duì)照。 |
| 樣品中目標(biāo)含量低 | 增加凝膠上的蛋白質(zhì)濃度。建議滴定。 |
| 一抗和二抗不匹配 | 確保二抗針對(duì)一抗的宿主物種。 |
| 轉(zhuǎn)移問(wèn)題 | 使用帶有顏色的蛋白質(zhì)標(biāo)記來(lái)檢查轉(zhuǎn)移。使用對(duì)照蛋白優(yōu)化轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移前檢查是否有氣泡。 |
| 洗次數(shù)太多 | 減少洗滌次數(shù)。 |
多頻段
| 可能是由于 | 嘗試這個(gè) |
|---|---|
| 凝膠超載 | 滴定加載在凝膠上的蛋白質(zhì)樣品。 |
| 使用過(guò)多抗體 | 使用一抗和二抗進(jìn)行滴定。包括已知的蛋白質(zhì)對(duì)照。 |
| 膠片曝光過(guò)度 | 嘗試較短的曝光時(shí)間。 |
| 阻塞問(wèn)題 | 使用新鮮的封閉液，增加封閉時(shí)間/溫度，嘗試不同的封閉劑。 |
| 目標(biāo)蛋白的翻譯后修飾 | 研究發(fā)表了目標(biāo)蛋白翻譯后修飾的例子，可以提供生物學(xué)解釋（即磷酸化、糖基化、核糖基化）。 |
| 翻譯后裂解 | 許多蛋白質(zhì)被合成為前蛋白質(zhì)，然后被切割成活性形式，例如前半胱天冬酶。研究針對(duì)您的目標(biāo)發(fā)布的示例。 |
| 拼接變體 | 選擇性剪接可能會(huì)產(chǎn)生由同一基因產(chǎn)生的不同大小的蛋白質(zhì)。研究針對(duì)您的目標(biāo)發(fā)布的示例。 |
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