一、背景

小鼠巨噬細胞是一種存在于小鼠體內(nèi)的免疫細胞，也稱為巨噬細胞系。巨噬細胞是一種多能性干細胞，可以分化為多種類型的細胞，包括樹突狀細胞、粒細胞和單核細胞等。

小鼠巨噬細胞在免疫系統(tǒng)中起著重要的作用。它們可以吞噬和消化細菌、病毒和其他微生物，從而保護機體免受感染。此外，巨噬細胞還可以分泌多種細胞因子和趨化因子，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。

在醫(yī)學(xué)研究中，小鼠巨噬細胞被廣泛用于研究免疫系統(tǒng)的功能和疾病機制。例如，通過將特定的基因?qū)胄∈缶奘杉毎?，可以研究這些基因?qū)γ庖呦到y(tǒng)的影響。此外，由于小鼠和人類的免疫系統(tǒng)存在一定的相似性，因此小鼠巨噬細胞也被用于研究人類免疫相關(guān)疾病的發(fā)病機制和治療方法。

二、小鼠巨噬細胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇小鼠巨噬細胞：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2)小鼠巨噬細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)小鼠巨噬細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。

下面T25瓶為例；

a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。

b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

三、應(yīng)用

小鼠巨噬細胞可以用于賈第蟲胞外囊泡激活小鼠巨噬細胞NLRP3炎性小體的分子機制：

分離鑒定賈第蟲胞外囊泡(GEVs),從GEVs誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞細胞炎性應(yīng)答角度研究,分析參與這一過程的關(guān)鍵炎性小體及其激活的分子機制;并分析GEVs中的蛋白質(zhì)組份信息,確定激活NLRP3炎性小體的單分子;最后通過動物試驗,確定GEVs關(guān)鍵分子介導(dǎo)的NLRP3炎性小體激活對蟲體感染的影響,進一步揭示其在賈第蟲致病中的作用。

1) GEVs刺激小鼠巨噬細胞模型建立。超速離心富集賈第蟲滋養(yǎng)體分泌的GEVs,透射電鏡下呈典型“杯狀”結(jié)構(gòu),粒徑大小為150 nm;激光共聚焦觀察GEVs能夠被宿主細胞主動吞噬進入胞內(nèi),并呈現(xiàn)時間依賴性;熒光定量PCR和ELISA實驗測定GEVs能夠激活小鼠腹腔巨噬細胞炎性應(yīng)答,并引起多種炎性細胞因子和趨化因子轉(zhuǎn)錄及分泌水平升高,且呈現(xiàn)劑量依賴性。結(jié)果表明賈第蟲能夠分泌GEVs,且可以進入宿主細胞內(nèi)激活宿主細胞炎性應(yīng)答。

2) 2)GEVs激活宿主小鼠巨噬細胞PRRs分子類型鑒定。GEVs刺激小鼠腹腔巨噬細胞后引起多種NLRs和TLRs轉(zhuǎn)錄水平升高,其中NLRP3和TLR2升高顯著;GEVs刺激使NLRP3受體呈現(xiàn)點狀激活并聚集于細胞核周圍、TLR2受體大量表達于細胞膜上;通過鉀離子外流和溶酶體損傷途徑阻斷NLRP3受體和阻斷TLR2受體均可以顯著下調(diào)多種炎性細胞因子和趨化因子轉(zhuǎn)錄水平、多種炎性細胞因子分泌水平和IL-1βp17蛋白表達水平。結(jié)果表明GEVs通過激活宿主TLR2和NLRP3信號通路調(diào)控宿主巨噬細胞炎性應(yīng)答。

3) GEVs激活小鼠巨噬細胞炎性小體第二信號的研究。GEVs刺激小鼠腹腔巨噬細胞引起NLRP3炎性小體關(guān)鍵蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平升高,在感染后6 h～24 h范圍內(nèi)caspase-1 p20的活化和IL-1βp17的分泌呈現(xiàn)先升高到12 h達到峰值然后降低的趨勢,在12.5μg～25μg范圍內(nèi)caspase-1 p20的活化和IL-1βp17的分泌呈現(xiàn)劑量依賴性升高;通過阻斷鉀離子外流途徑、溶酶體損傷途徑、caspase-1活化途徑、泛caspase-1激活途徑阻斷NLRP3炎性小體激活,可以不同程度下調(diào)IL-1β的基因轉(zhuǎn)錄、蛋白分泌和表達,且溶酶體損傷途徑和泛caspase-1途徑更為顯著;阻斷IL-1β后能夠顯著下調(diào)其它炎性細胞因子IL-6和TNF-α的轉(zhuǎn)錄和分泌水平。結(jié)果表明GEVs能夠通過溶酶體損傷途徑激活宿主NLRP3炎性小體,調(diào)控IL-1βp17的分泌并介導(dǎo)宿主炎性應(yīng)答。

4)GEVs激活小鼠巨噬細胞炎性小體信號的研究。GEVs刺激小鼠腹腔巨噬細胞和THP-1細胞均能促進賈第蟲介導(dǎo)的NLRP3炎性小體信號pro-IL-1β和其它炎性因子IL-6/TNF-α的轉(zhuǎn)錄和分泌;GEVs刺激宿主細胞,在0h～4 h內(nèi),引起p38在2 h磷酸化水平達到峰值、ERK和AKT在4 h磷酸化達到峰值,阻斷p38和ERK通路可以顯著下調(diào)IL-1β和其它炎性因子IL-6/TNF-α的轉(zhuǎn)錄和分泌,而阻斷AKT通路可以顯著上調(diào)這些炎性因子的轉(zhuǎn)錄和分泌;GEVs刺激宿主細胞,可引起NF-κB p65入核,在0 h～4 h內(nèi),引起p-p65和p-IKKαβ均在1 h磷酸化水平達到峰值而T-IκBα降解至水平,阻斷IκBα磷酸化來抑制NF-κB通路可以顯著下調(diào)NLRP3炎性小體信號IL-1β和其它炎性因子IL-6/TNF-α的轉(zhuǎn)錄和分泌。

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