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兔抗人多克隆抗體BRCA操作注意事項

來源:上海研生實業(yè)有限公司   2025年07月17日 15:00  

兔抗人多克隆抗體BRCA操作注意事項

實驗操作中的關(guān)鍵控制點

1. 抗體稀釋與平衡:

建議使用抗體供應商推薦的稀釋緩沖液(通常為含1% BSA的PBS),避免使用含有疊氮化NA的緩沖液,以防影響抗體活性。稀釋后的抗體應在冰上靜置15分鐘使其充分平衡,再進行后續(xù)操作。注意:稀釋比例需根據(jù)預實驗結(jié)果優(yōu)化,不同樣本類型(如石蠟切片/冰凍切片/細胞爬片)可能需求不同。

2. 抗原修復的精準控制:

對于石蠟切片,建議采用pH 6.0檸檬酸鈉緩沖液進行熱誘導抗原修復(98℃ 20分鐘),修復后自然冷卻至室溫,避免驟冷導致抗原表位結(jié)構(gòu)變化。若使用酶修復法(如胰蛋白酶),需嚴格控制酶解時間(通常37℃ 10-15分鐘),過度消化會破壞組織形態(tài)。

3. 封閉步驟的優(yōu)化:

使用5%正常山羊血清(與二抗同源)封閉30分鐘可有效降低非特異性結(jié)合。對于高背景問題,可嘗試加入0.1% Triton X-100提高通透性,或采用3% BSA+5%血清的復合封閉液。注意:封閉時間超過1小時可能導致信號減弱。

結(jié)果判讀與疑難解析

1. 陽性對照的必要性:

每批次實驗應設置已知BRCA陽性的組織切片(如乳腺癌組織)作為陽性對照,同時設立空白對照(PBS替代一抗)和陰性對照(同型IgG)。若陽性對照未顯色,需排查抗體效價或?qū)嶒灹鞒虇栴}。

2. 非特異性染色的鑒別:

邊緣效應(組織周邊深染)多因抗體揮發(fā)導致濃度不均,可通過增加孵育盒濕度改善;胞漿彌漫性著色可能源于內(nèi)源性過氧化物酶殘留,建議新鮮配置3% H2O2甲醇溶液延長封閉時間至15分鐘。

3. 信號弱化的解決方案:

若目標信號微弱,可嘗試:① 延長一抗孵育時間(4℃過夜);② 采用TSA信號放大系統(tǒng);③ 更換顯色底物(如DAB延長顯色至10分鐘)。需注意:過度延長顯色時間可能增加背景噪音。

抗體保存與質(zhì)量控制

1. 分裝凍存規(guī)范:

收到抗體后應立即分裝(建議10μL/管),避免反復凍融。長期保存應置于-80℃,短期使用可存放4℃(不超過1個月)。解凍時置于冰上緩慢復融,渦旋震蕩混勻后離心取上清。

2. 效價驗證周期:

即使妥善保存,也建議每6個月通過Western Blot驗證抗體特異性(使用BRCA過表達的細胞裂解液)。若出現(xiàn)條帶位置偏移或雜帶增多,應考慮更換新批次抗體。


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