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了解BCA蛋白濃度測(cè)定原理

來(lái)源:北京索萊寶科技有限公司   2025年07月22日 09:10  

BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒組成

產(chǎn)品簡(jiǎn)介:

堿性條件下,蛋白將Cu2+還原為Cu+, Cu+與BCA試劑形成紫藍(lán)色的絡(luò)合物,測(cè)定其在562nm處的吸收值,并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比,即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。常用濃度的去垢劑SDS,Triton X-100,Tween不影響檢測(cè)結(jié)果,但受螯合劑(EDTA, EGTA)、還原劑(DTT,巰基乙醇)和脂類的影響。實(shí)驗(yàn)中,若發(fā)現(xiàn)樣品稀釋液或裂解液本身背景值較高,可試用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒。

操作說(shuō)明:

一. 微孔酶標(biāo)儀法

1. 配制工作液:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量,按50體積BCA試劑加1體積Cu試劑(50:1)配制成BCA工作液,充分混勻(混合時(shí)可能會(huì)有渾濁,但混勻后就會(huì)消失)。BCA工作液室溫24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2. 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品:取10μL BSA標(biāo)準(zhǔn)品用PBS稀釋至100μL(樣品一般可用PBS稀釋),使終濃度為0.5mg/mL。將標(biāo)準(zhǔn)品按0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20μL加到96孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中,加PBS補(bǔ)足至20μL。

3. 將樣品作適當(dāng)稀釋(最好多做幾個(gè)梯度,如作2倍、4倍、8倍稀釋),加20μL到96孔板的樣品孔中。由于移液器在取小量樣品時(shí)誤差偏大,標(biāo)準(zhǔn)線前面的點(diǎn)可能不很準(zhǔn)確,所以盡可能的讓樣品點(diǎn)落在標(biāo)準(zhǔn)線1/2后。

4. 各孔加入200μL BCA工作液,37℃放置15-30分鐘。用酶標(biāo)儀測(cè)定A562nm,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。使用溫箱孵育時(shí),應(yīng)注意防止因水分蒸發(fā)影響檢測(cè)結(jié)果。

二. 分光光度計(jì)法 如沒(méi)有酶標(biāo)儀,可用分光光度計(jì)在離心管中混勻后加入比色皿中比色。 步驟如下:

1. 配制工作液: 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量,按50體積BCA試劑加1體積Cu試劑(50:1)配制成BCA工作液,充分混勻(混合時(shí)可能會(huì)有渾濁,但混勻后就會(huì)消失)。BCA工作液室溫24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2. 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品:取100μL BSA標(biāo)準(zhǔn)品用PBS稀釋至1mL(樣品一般可用PBS稀釋),使終濃度為0.5mg/mL。

3. 取八支(或者更多)5mL離心管,標(biāo)上號(hào),按下表加入試劑。

BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

4.37℃放置15-30分鐘。用分光光度計(jì)測(cè)562nm處吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。

注意事項(xiàng):

1. 長(zhǎng)期不用時(shí),Cu試劑與PBS稀釋液可置于2-8℃保存,如發(fā)現(xiàn)細(xì)菌污染則應(yīng)丟棄。BCA試劑在低溫條件下出現(xiàn)結(jié)晶沉淀時(shí),可37℃溫育使充分溶解, 不影響使用。

2. 樣品中若含有較多干擾物質(zhì)時(shí),請(qǐng)采用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒。

3. 為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。


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