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惰性聯(lián)苯柱在類(lèi)固醇及其 Ⅱ 相代謝物分析中的應(yīng)用
惰性聯(lián)苯柱在類(lèi)固醇及其 Ⅱ 相代謝物分析中的應(yīng)用
前言 Restek LC
目前，不銹鋼是市面上制造液相色譜柱柱管的首_選材料，相比玻璃，聚合物以及鈦合金，不銹鋼具有優(yōu)秀的耐壓性和機(jī)械強(qiáng)度，較高的化學(xué)穩(wěn)定性和耐腐蝕性，易于加工制造成型且成本效益高，是一位綜合素質(zhì)很高的六邊形戰(zhàn)士。
不過(guò)，六邊形戰(zhàn)士遇到了一個(gè)令人撓頭的問(wèn)題，當(dāng)分析一些極性化合物時(shí)，比如含硫或者含氮化合物，分析物與不銹鋼表面經(jīng)常會(huì)發(fā)生非特異性吸附（NSA），這種吸附會(huì)引發(fā)一系列不良后果，比如峰形拖尾、回收率降低，甚至?xí)?duì)整體的分離效果產(chǎn)生顯著的影響。
01
非特異性吸附與惰性硬件
RESTEK LC
圖 A：常規(guī) 316 不銹鋼柱表面為厚度約為 2 nm 的富 Cr 氧化物層；該金屬氧化物層的等電點(diǎn)（IEP）為 7，在酸性色譜條件下，部分活性位點(diǎn)與待測(cè)物發(fā)生金屬螯合作用，是非特異性吸附的根本原因。
Restek 敏銳地發(fā)現(xiàn)了這一問(wèn)題，并推出了可以解決非特異性吸附的 Inert 惰性液相柱。Inert 惰性液相柱 采用化學(xué)氣相沉積（CVD）技術(shù)對(duì)柱管內(nèi)表面進(jìn)行處理，即在柱管內(nèi)壁形成有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化涂層，隔絕了待測(cè)物與金屬表面的相互作用，為色譜柱提供了良好的惰性。
圖 B：惰性液相色譜柱的內(nèi)壁經(jīng)過(guò)化學(xué)改性，其表面為有機(jī)-無(wú)機(jī)混合涂層（500 nm），從而防止了金屬與分析物之間的相互作用。
02
柱管的影響及數(shù)據(jù)分析
RESTEK
在本次的液相柱性能對(duì)比研究中，我們采用聯(lián)苯柱分析類(lèi)固醇及其 II 相代謝物。聯(lián)苯與 C18 的選擇性有很大的不同， 由于苯環(huán)提供的 π-π 作用以及空間結(jié)構(gòu)的識(shí)別能力，使得聯(lián)苯柱特別擅長(zhǎng)分離芳香化合物及其同分異構(gòu)體；與未經(jīng)惰性處理的常規(guī)液相柱相比，惰性柱提供了更好的峰形和更高的響應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，使用帶惰性涂層的液相柱可以減輕非特異吸附（NSA），不需要重復(fù)進(jìn)樣或在流動(dòng)相中添加可能降低系統(tǒng)靈敏度的試劑，就可以獲得穩(wěn)定的色譜性能。
目標(biāo)化合物：
分析條件 (Acquity H-Class UPLC+ Waters XevoTQ-XS ) | |
分析柱 | 1. X品牌常規(guī)液相柱：Biphenyl 1.7μm, 100 mm x 2.1 mm 2. Raptor Biphenyl 1.8μm, 100 x 2.1 mm (Restek 常規(guī)不銹鋼柱，貨號(hào)：9309212) 3. Raptor Inert Biphenyl 1.8μm, 100 mm x 2.1 mm (Restek 惰性液相柱，貨號(hào)：9309212-T) |
流動(dòng)相 A | 水（0.01% 甲酸） |
流動(dòng)相 B | 甲醇（0.01% 甲酸） |
洗脫梯度 | 時(shí)間 (min) | %B |
0.00 | 40 | |
18.00 | 100 | |
18.01 | 40 | |
24.00 | 40 |
流速 | 0.4 mL / min |
進(jìn)樣量 | 5 µL （稀釋液為水:甲醇= 1:1 v/v） |
柱溫 | 60°C |
離子化 和掃描模式 | ESI + &ESI-， MRM |
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03
結(jié)果對(duì)比: 常規(guī)保護(hù)柱 vs 惰性保護(hù)柱
RESTEK
下表展示了常規(guī)分析柱、常規(guī)保護(hù)柱、惰性分析柱、惰性保護(hù)柱在 4 種組合使用方式下，標(biāo)準(zhǔn)品（A）和從血漿（B）中提取的硫酸脫氫表雄酮（100 ng/mL）的半峰寬，對(duì)稱(chēng)因子和峰高的比較，實(shí)驗(yàn)證明，惰性保護(hù)柱與惰性分析柱的組合表現(xiàn)最好。
保護(hù)柱/分析柱，I 代表惰性，C 代表常規(guī)
04
為什么選擇聯(lián)苯固定相
RESTEK
聯(lián)苯固定相與待測(cè)物之間的 π-π 作用和空間結(jié)構(gòu)識(shí)別能力，為異構(gòu)體提供了良好的分離。使用經(jīng)優(yōu)化的色譜方法獲得的一些關(guān)鍵類(lèi)固醇（異構(gòu)體）的 MRM 圖如下：
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05
類(lèi)固醇種類(lèi)擴(kuò)展分析
RESTEK
使用在惰性聯(lián)苯柱上建立的分析方法，從六名健康志愿者的混合血漿樣本中檢測(cè)到 52 種類(lèi)固醇。
上圖為 MRM 圖，下圖的橫坐標(biāo)為 RT（min），縱坐標(biāo)為母離子（m/z）,每個(gè)圓的面積與對(duì)應(yīng)峰強(qiáng)度成正比。
惰性柱有助于提高類(lèi)固醇及其 II 相代謝物的分辨率，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量（特別是硫酸化代謝物在常規(guī)柱分析中容易發(fā)生色譜峰拖尾，特征離子在高豐度的情況下也會(huì)面臨離子抑制，從而造成定量的不準(zhǔn)確）。
06
研究總結(jié)
RESTEK
1
LC-MS 分析類(lèi)固醇的 II 相代謝物過(guò)程中，液相柱柱管內(nèi)壁的非特異性吸附會(huì)對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生顯著的不良影響。
2
對(duì)于所有硫酸化和葡萄糖醛酸化的類(lèi)固醇，使用未經(jīng)鈍化處理的液相柱，會(huì)產(chǎn)生明顯的非特異性吸附，并導(dǎo)致峰展寬。為了消除這種負(fù)面作用，嘗試在流動(dòng)相中加入甲酸銨，但是導(dǎo)致了保留時(shí)間的改變和 MS 靈敏度的降低。
3
惰性柱避免了這一問(wèn)題，使類(lèi)固醇 II 相代謝物分析更準(zhǔn)確。
4
聯(lián)苯固定相與待測(cè)物之間的 π-π 作用和空間結(jié)構(gòu)識(shí)別能力，為異構(gòu)體提供了良好的分離。
5
新建立的分析方法在復(fù)雜的生物基質(zhì)（人血漿）中得到了驗(yàn)證，其中 II 相代謝物與數(shù)百種其他類(lèi)固醇化合物一起進(jìn)行了分析，證明了惰性柱分析類(lèi)固醇及其代謝物具有明顯優(yōu)勢(shì)。
07
Restek Inert 惰性液相柱選擇指南
RESTEK
看完關(guān)于惰性聯(lián)苯柱在生物相關(guān)代謝物分析中的應(yīng)用后，您實(shí)際工作中的問(wèn)題是否得到了解答呢？如您有任何疑問(wèn)，歡迎撥_打 4000 815 005 熱線聯(lián)系 Restek 技術(shù)團(tuán)隊(duì)。同時(shí)您還可申請(qǐng)產(chǎn)品試用，優(yōu)異性能，即刻體驗(yàn)！
研究合作單位
Restek Corporation
瑞思泰康科技有限公司
School of Pharmaceutical Sciences, University of Geneva
日內(nèi)瓦大學(xué)藥學(xué)院
Institute of Pharmaceutical Sciences of Western Switzerland University of Geneva
日內(nèi)瓦大學(xué)瑞士西部制藥科學(xué)研究所
Swiss Centre for Applied Human Toxicology (SCAHT)
瑞士人類(lèi)應(yīng)用毒理學(xué)中心
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