采用粘末端連接必須對(duì)目的DNA分子和載體分子進(jìn)行酶切以獲得相應(yīng)的粘末端進(jìn)行連接。酶切可以是單酶切也可以是雙酶切。單酶切操作比較簡(jiǎn)單，但雙酶切如果兩種酶所用緩沖液成分不同（主要是鹽離子濃度不同）或反應(yīng)溫度不同，這時(shí)可以采用如下措施解決：1）先用一種酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一種酶切；2）先進(jìn)行低鹽要求的酶酶切，然后添加鹽離子濃度到高鹽的酶反應(yīng)要求，加入第二種酶進(jìn)行酶切；3）使用通用緩沖液進(jìn)行雙酶切。具體要根據(jù)酶的反應(yīng)要求進(jìn)行，盡量避免星號(hào)活力。

一 材料、試劑和儀器：

1 材料：質(zhì)粒DNA

2 試劑：限制性?xún)?nèi)切酶、ddH₂O

3 儀器：微量移液槍?zhuān)x心機(jī)，水浴鍋， 電泳儀，紫外透射觀測(cè)儀

實(shí)驗(yàn)程序：

I. .單酶切：

II. 雙酶切：

注：酶切的選擇原則一般是盡量擴(kuò)大酶切體系，這樣抑制因素得以稀釋?zhuān)换蚪MDNA或質(zhì)粒DNA酶的用量較一般DNA大，一般為1μg/10U;所加酶的體積不能超過(guò)酶切總體積的1/10，否則濃度會(huì)超過(guò)5%，會(huì)產(chǎn)生星號(hào)活力；對(duì)難切的質(zhì)粒或基因組DNA應(yīng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間4―5hr, 甚至。滅火限制性?xún)?nèi)切酶活性可以采用加熱滅活，乙醇沉淀，酚/氯仿抽提，添加EDTA或SDS等方法，具體每一種酶可能有些方法不能*滅活，這一點(diǎn)需要注意。

二. 結(jié)果與分析：

圖1 重組質(zhì)粒HindIII XbaI雙酶切瓊脂糖凝膠電泳分析

假若一種酶在環(huán)狀質(zhì)粒DNA中只有一個(gè)酶切位點(diǎn), 且酶切*，紫外燈下檢測(cè)電泳結(jié)果, 則單酶切應(yīng)為一條帶, 而雙酶切則為兩條帶。如果條帶數(shù)目多于理論值,那么有可能是酶切不*。如果酶切結(jié)果與酶切前的質(zhì)粒條帶一樣（超螺旋、線性和開(kāi)環(huán)三條帶），則說(shuō)明質(zhì)粒*沒(méi)有被切開(kāi)。

M1 ： λ DNA/ HindIII M2：DL2000 1 - 6: 重組質(zhì)粒HindIII XbaI

重組質(zhì)粒用HindIII XbaI雙酶切后釋放出插入片斷，因此空載體處于同一水平位置，而插入片斷長(zhǎng)度分別為0.8 ,2.1 ,1.6 ,1.2 ,0.7和 0.3kb。