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DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：植物組織制備基因組DNA實(shí)驗(yàn)
利用基因組DNA較長(zhǎng)的特性，可以將其與細(xì)胞器或質(zhì)粒等小分子DNA分離。在提取過程中，染色體會(huì)發(fā)生機(jī)械斷裂，產(chǎn)生大小不同的片段，因此分離基因組DNA時(shí)應(yīng)盡量在溫和的條件下操作，如盡量減少酚/氯仿抽提、混勻過程要輕緩， 以保證得到較長(zhǎng)的DNA。
實(shí)驗(yàn)方法
- 氯化銫法
- CTAB法
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | 加入一定量的異丙醇或乙醇，基因組的大分子DNA即沉淀形成纖維狀絮團(tuán)飄浮其中， 可用玻棒將其取出，而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部， 從而達(dá)到提取的目的。 |
|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 | 植物組織 |
| 試劑、試劑盒 | 抽提緩沖液 十二烷基肌氨酸鈉 TE 異丙醇 溴化乙錠 氯化銫 |
| 儀器、耗材 | 離心機(jī) |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 1. 收取10~50 g 新鮮的植物組織。 2. 植物組織用冷的無菌水洗滌、吸干，放人液氮中凍結(jié)，用研缽和研杵研成細(xì)粉。 3. 將凍結(jié)的細(xì)粉放入250 ml 的離心瓶中，立即加入抽提緩沖液約每克植物5~10 ml，輕輕攪拌混勻。 4. 加入十二烷基肌氨酸鈉使終濃度達(dá)1%，于溫育1~2 h。 5. 用JA-14轉(zhuǎn)子4℃，5 500 g 離心10min 保留上清，必要時(shí)重復(fù)此歩驟以除去殘?jiān)?br /> 6. 加人0.6體積異丙醇，混合，如果看不見沉淀，于-20℃放置30 min，用JA-14轉(zhuǎn)子4℃，7 500 g 離心15 min，棄上清。 7. 沉淀用9 ml TE緩沖液重懸，加入9.7 g 固體氯化銫，混勻，冰上放置30 min，用JA-14轉(zhuǎn)子，7 500 g 離心10 min，保留上清。 8. 加入0.5 ml 10 mg/ml 的溴化乙錠，冰上放置30 min，4℃ 7500 g 離心10min. 9. 將上清轉(zhuǎn)入兩個(gè)5 ml 的快封超離心管中，并封口。 10. 用VTi80轉(zhuǎn)子20℃ 525 000 g 離心4 h，或20℃，300 000 g 離心，用15號(hào)針頭和注射器收集帶。 11. 用氯化艷飽和的異丙醇重復(fù)抽提DNA以除去溴化乙錠。 12. 加入2體積水和6體積100%乙醇，混勻，-20℃放置1 h，用JA-20或JA-21轉(zhuǎn)子4℃，7500 g 離心10 min。 13. 沉淀用TE緩沖液重懸，加入1/10體積的3 mol/l 乙酸鈉和2體積的100%乙酵重懸，重復(fù)離心。 14. 沉淀晾干后用TE緩沖液重懸 |
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