Wistar大鼠乳鼠

FBS DMEM 胰蛋白酶 EDTA 酒精

眼科剪 滴管 離心機 培養(yǎng)皿 CO2培養(yǎng)箱

1. 新生1-2 天Wistar大鼠乳鼠，經(jīng)75%酒精消毒，斷頭處死。

2. 取腦放入冷的D-Hanks’平衡鹽溶液，去除腦膜及大血管。

3. 分離兩側(cè)大腦皮質(zhì)并剪成1mm³ 大小，加入0.25%胰蛋白酶37℃空氣浴震蕩消化10 min。

4. 用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，離心(1 000 rpm，10 min)，去上清。

5. 用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸沉淀，經(jīng)75 µm 篩網(wǎng)過濾，收集濾液，再次離心10 min，收集沉淀用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度至1.5×10⁶/ml，種植于75 cm² 培養(yǎng)瓶。

6. 經(jīng)1 小時差速黏附去除成纖維細胞后，將細胞懸液轉(zhuǎn)移到一新的75 cm² 培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，兩天換液一次。

7. 7 天后將培養(yǎng)瓶放入水平搖床(260 rpm，2 h，37℃)，換液棄除小膠質(zhì)細胞，放入培養(yǎng)箱平衡1 小時，重新置于水平搖床18 h。

8. 換液棄除少突膠質(zhì)細胞，用新鮮培養(yǎng)基洗2 遍，加入0.25%胰蛋白酶與0.02% EDTA 1:1 混合液消化、傳代備用。

二、 形態(tài)學(xué)觀察

倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長狀況。

三、 細胞生長曲線繪制

傳代后的細胞以 2×10⁴/ml 的密度種植于24 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，3 天換液1 次， 每24 小時取3 孔計數(shù)，連續(xù)7 天，取均值繪制生長曲線。

四、星型膠質(zhì)細胞的鑒定

膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫細胞組織化學(xué)鑒定方法。取星型膠質(zhì)細胞去除培養(yǎng)基，用PBS洗3 遍，4%多聚甲醛室溫固定1 小時，PBS洗3 次，每次5 分鐘，0.3% H₂O₂ 30 分鐘以去除內(nèi)源性過氧化物，PBS洗3 次每次5 分鐘，加含0.5% Triton X-100 的山羊血清封閉30 分鐘，滴加兔抗GFAP 抗體(1:75)，4℃ 18 小時，PBS洗3 次每次5 分鐘，滴加生物素標記羊抗兔IgG，室溫20 分鐘，PBS洗3 次，每次5 分鐘，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫20 分鐘，PBS洗3 次，每次5 分鐘，DAB顯色。

1. 形態(tài)學(xué)觀察：光鏡下，傳代的星型膠質(zhì)細胞折光性強，形狀不規(guī)則，主要為多角形，胞體大而扁平、胞質(zhì)豐富，細胞核圓形或卵圓形，偏于胞體一側(cè)，內(nèi)有1-2 個核仁，有多個粗短枝狀初級胞突，部分細胞突起變細變長，6-7 天后細胞融合成單層，符合神經(jīng)膠質(zhì)細胞生長特性，如下圖。
 

星型膠質(zhì)細胞單層生長(×100)

2.  鑒定：細胞經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)染色98%以上均為細胞漿著色，而胞核未見著色，見下圖，證明采用上述方法獲得的細胞為星型膠質(zhì)細胞，純度高， 可用于實驗。

圖2：免疫組化鑒定，GFAP 染色

3. 細胞生長曲線繪制如下：

圖3：細胞生長曲線

SD大鼠

苯巴比妥 解剖液 胰蛋白酶 Dnase DM培養(yǎng)液

離心管 培養(yǎng)箱 手術(shù)器材

一、 取14.5d SD大鼠一只。

二、 苯巴比妥0.5 ml 腹腔注射，待麻醉后置于手術(shù)臺上，酒精棉球消毒皮膚，開腹取出子宮（約12-14個），放入解剖液中，剖開子宮，取出胚胎，放入解剖液中，在耳眼之間離斷，取頭側(cè)部組織，去除腦膜組織，取原始中腦區(qū)組織，放入離心管裝的解剖液中，待全部取出后，1500轉(zhuǎn)2分鐘。

三、 用吸管吸出上清液，在組織細胞沉淀中加入胰蛋白酶一管（1 ml/vial），室溫30分鐘，1500轉(zhuǎn)，離心5分鐘（離心前可加入解剖液以終止胰酶作用）。

四、吸去上清，在組織細胞沉淀中加入Dnase 一管（2 ml/vial），37℃反應(yīng)10分鐘，1500轉(zhuǎn)，離心5分鐘，吸去上清，在組織細胞沉淀中加入2 ml DM培養(yǎng)液吹打，計數(shù)（計數(shù)公式為（N1+N2+N3+N4）/4*10 _⁴），以3*10⁵個/瓶在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，做好標記（時間、原代還是第幾代傳代，姓名，細胞名稱等），放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.  麻醉藥劑量應(yīng)梢大于普通用量。

2.   一定要仔細剔除干凈腦膜組織，否則會極大地影響培養(yǎng)細胞的純度。

3.  細胞培養(yǎng)技術(shù)不同于分子生物學(xué)，由于離心速度較慢，離心組織和細胞貼壁不如核酸緊密，取出離心后的上清液時一定要用吸管吸取，禁止用傾倒的方法。

4.  為保護胚胎，胚胎操作應(yīng)在放置冰塊的托盤中進行，保持低溫。

5.  取中腦組織時應(yīng)先用兩把鑷子夾住所取區(qū)域，然后用刀片切開。

6.  胰酶在細胞離心時會對細胞產(chǎn)生毒性，所以胰酶離心前可加入一定的解剖液稀釋。

7.  細胞離心時在冰凍離心機內(nèi)進行，以保持細胞活力。

8.  吹打細胞前用火燒吸管頭，發(fā)紅時逐漸后退，使吸管尖變鈍，減少吹打過程中對細胞的損害，實驗中也發(fā)現(xiàn)吹打時有一定的阻力。

9.  鼠胚胎較多時可分批消化，否則體外時間較長，細胞存活率低。

10.  用Neurobasal medium + B27。

11.   胰酶消化時加入EDTA可增強消化效果。

12.  關(guān)鍵在于取材的準確和原代細胞的狀態(tài)。

大鼠胚胎

L-15培養(yǎng)基 膠原酶 Dnase D-MEM-BS FCS-DMEM 阿糖胞苷

離心機 水浴鍋 培養(yǎng)瓶 培養(yǎng)箱

一、分離大鼠胚胎（16-18周）新皮層，置于L-15（或Hank’s平衡鹽/DMEM溶液，無Hepes）培養(yǎng)基中，除去腦膜和血管、海馬、尾核和其他非皮層組織。

二、 用解剖刀將其切成1 mm³大小的組織塊。

三、用1ml槍頭轉(zhuǎn)移250 μl膠原酶儲存液（1.33%，溶于L-15中）到1ml的L-15（或D-MEM）中。每2只鼠腦組織塊使用1-1.5 ml稀釋膠原酶液。

四、37℃水浴中孵育30 min。

五、1 000 rpm(大約230g)中離心5 min，或3 000 rpm(大約2 000 g)中離心1 min。

六、去上清。

七、在含EDTA-CMF的溶液中重懸細胞，并與胰蛋白酶以1：4～1：10比例混合。可以根據(jù)觀察到的細胞消化的情況，適當調(diào)整兩者的比例。

八、加入胰蛋白酶的抑制劑和DNase溶液，混合5分鐘。

九、1 000 rpm(大約230 g)中離心5 min，或3 000 rpm(大約2 000 g)中離心1 min。

十、去上清。加入500 μl D-MEM-BS。

十一、輕輕吹打成單細胞懸液，開始用5 ml槍頭吹打10次，在需要時用18-gauge的針頭吹打。( 注意：不要產(chǎn)生氣泡。）200目/300目尼龍網(wǎng)過濾。

十二、將細胞轉(zhuǎn)移到含10%FCS-DMEM的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)密度為2X10⁶/25 cm²培養(yǎng)瓶，4～6 X10⁶/75 cm³培養(yǎng)瓶。在37.2℃，37.5%中培養(yǎng)。

十三、第2天換液，以后每隔3天換液。

十四、7-10天，細胞發(fā)生融合。

十五、細胞融合后，將瓶蓋用封口膜密封好，在軌跡搖床上培養(yǎng)，旋轉(zhuǎn)速度以不產(chǎn)生氣泡為宜。37℃振搖過。細胞注意避光。

十六、去上清，加入新鮮10%FCS-DMEM。

十七、加入200 μl 1 mM的阿糖胞苷/10 ml培養(yǎng)基。在37.2℃，37.5%中培養(yǎng)孵育48小時以消除分裂的細胞。

十八、換用新鮮10%FCS-DMEM，孵育恢復(fù)24小時。

十九、重復(fù)17-18步驟，消除所有的分裂細胞