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細胞培養(yǎng)-培養(yǎng)細胞的取材2010/03/01
細胞培養(yǎng)--培養(yǎng)細胞的取材人和動物體內(nèi)絕大部分組織都可以在體外培養(yǎng)，但其難易程度與組織類型、分化程度、供體的年齡、原代培養(yǎng)方法等有直接關(guān)系，原代取材是進行組織培養(yǎng)的*步。取材的基本要求（1）取材的組織盡快培養(yǎng)。因故不能即時培養(yǎng)，可將組織浸泡于培養(yǎng)液內(nèi)，放置于冰浴或4度冰箱中。如果組織塊很大，應(yīng)先將其切成1cm3以下的小塊再低溫保存，但時間不能超過24h。（2）取材時應(yīng)嚴(yán)格無菌操作，用無菌包裝的器皿或用事先消毒好的，帶少許培養(yǎng)液的小瓶等便于攜帶的物品取材，取材過程中要盡量避免紫外線照射和接觸化學(xué)試
細胞因子介紹 2010/02/24
為了維持機體的生理平衡，抵抗病原微生物的侵襲，防止腫瘤發(fā)生，機體的許多細胞，特別是免疫細胞合成和分泌許多種微量的多肽類因子。它們在細胞之間傳遞信息，調(diào)節(jié)細胞的生理過程，提高機體的免疫力，在異常情況下也有可能引起發(fā)燒、炎癥、休克等病理過程。這樣一大類因子已發(fā)現(xiàn)的有上百種，統(tǒng)稱為細胞因子，包括淋巴細胞產(chǎn)生的淋巴因子、單核細胞產(chǎn)生的單核因子、各種生長因子等。許多細胞因子是根據(jù)它們的功能命名的，如白細胞介素（IL）、干擾素（IFN）、集落刺激因子（CSF）、腫瘤壞死因子（TNF）、紅細胞生成素（EPO）
磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）2010/02/23
磷脂酰絲氨酸外翻分析（AnnexinV法）磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中（圖3）。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（propidine
ELISA的操作要點2010/02/01
ELISA的操作要點的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。ELISA的操作因固相載體的形成不同而有所差異，國內(nèi)醫(yī)學(xué)檢驗一般均用板式點。本文將敘述板式ELISA各個操作步驟的注意要點，珠式、管式及磁性球ELSIA，國外試劑均與特殊儀器配合應(yīng)用，兩者均有詳細的使用說明，嚴(yán)格遵照規(guī)定操作，必能得出準(zhǔn)確的結(jié)果。4.1標(biāo)本的采取和保存可用作ELISA測定的標(biāo)本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標(biāo)本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)
ELISA實驗基本原理2010/01/29
ELISA實驗基本原理基本原理1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）用于IgG定量測定的文章，使得1966年開始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測定方法。這一方法的基本原理是：①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶
無血清培養(yǎng)基2010/01/28
無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基（serumfreemedium,SFM）:是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎(chǔ)培養(yǎng)基加少量血清所配制的*培養(yǎng)基可以滿足大部分細胞培養(yǎng)的要求，但對有些實驗卻不適合，如觀察一種生長因子對某種細胞的作用，這時需要排除其他生長因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長因子；又如需要測定某種細胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物。無血清培養(yǎng)基
實驗動物的處死方法2010/01/27
緩沖液使用液濃貯存液（每升）Tris-乙酸（TAE）1×：0.04mol/LTris-乙酸50×：242gTris堿0.001mol/LEDTA57.1ml冰乙酸100ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）Tris-磷酸（TPE）1×:0.09mol/LTris-磷酸10×:10gTris堿0.002mol/LEDTA15.5ml85%磷酸（1.679g/ml）40ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）Tris-硼酸（TBE）a0.5×0.045mol/LTris-硼酸5×：54gTri
分子生物學(xué)常用試劑配置2010/01/27
分子生物學(xué)常用試劑配置分子生物學(xué)常用試劑配置一、分子生物學(xué)常用貯存液的配制1．30%丙烯酰胺溶液【配制方法】將29g丙烯酰胺和1gN，N’-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為60ml的水中。加熱至37℃溶解之，補加水至終體積為100ml。用濾器（0.45μm孔徑）過濾除菌，查證該溶液的pH值應(yīng)不大于7.0，置棕色瓶中保存于室溫?！咀⒁狻勘０肪哂泻軓姷纳窠?jīng)毒性并可以通過皮膚吸收，其作用具累積性。稱量丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺時應(yīng)戴手套和面具?？烧J(rèn)為聚丙烯酰胺無毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因為它還可能會含有少量未
檢測細胞凋亡的幾種方法2010/01/25
檢測細胞凋亡的幾種方法一、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）核小體測定凋亡細胞的DNA斷裂使細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成，可由ELISA法檢測。（一）檢測步驟1、將凋亡細胞裂解后高速離心，其上清液中含有核小體；2、在微定量板上吸附組蛋白體’3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結(jié)合‘4、加辣過氧化物酶標(biāo)記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結(jié)合’4、加酶的底物，測光吸收制。（二）用途該法敏感性高，可檢測5*100/ml個凋亡細胞?？捎糜谌?、大鼠、小鼠的凋亡檢測。該法
Western Blotting的常見問題及解決方法2010/01/22
WesternBlotting的常見問題及解決方法問題出現(xiàn)的原因解決方法1.膠片上存在反轉(zhuǎn)印象（如:亮的條帶.黑的背景）HRP的濃度過高稀釋HRP至少10倍2.膜上有黃色或棕色的沉積HRP的濃度過高稀釋HRP至少10倍3.在暗室中條帶過于明亮HRP的濃度過高稀釋HRP至少10倍4.條帶的發(fā)光時間持續(xù)了至少8小時HRP的濃度過高稀釋HRP至少10倍5.信號太弱或沒有1.太多的HRP積聚導(dǎo)致信號快速的消退2.抗原或抗體的濃度不夠3.轉(zhuǎn)印不成功4.HRP或其他底物的效價降低1.稀釋HRP至少10倍2.
陰性結(jié)果常見原因2010/01/22
陰性結(jié)果常見原因①確認(rèn)是否忽略了應(yīng)該加的某種試劑，包括一抗、二抗、三抗及底物等。②確認(rèn)所有的試劑是否按正確的順序滴加，是否孵育了足夠的時間。③對照抗體的標(biāo)簽確認(rèn)是否使用了正確的抗體，以及所用的檢測系統(tǒng)是否和一抗匹配。如，一抗是兔來源，一定要用抗兔的二抗來匹配；或一抗是羊來源，必須用抗羊的二抗來匹配。④檢查抗體所使用的稀釋度及稀釋溶液是否正確。一抗的稀釋液不能用來稀釋二抗。⑤檢查抗體的有效期和保存條件，尤其是標(biāo)記了酶或熒光素的抗體。不要與揮發(fā)性有機溶劑一起保存，以免降低抗體的效價。要求冷凍保存的抗
蛋白酶的底物特異性（sigma的合成底物）2010/01/20
蛋白酶的底物特異性（sigma的合成底物）問：新篩選的蛋白酶，用sigma合成底物測其底物特異性，包括lys－pNA,phe－pNA,leu－pNA，ala－nitroanilidehydrochloride，glu－nitroanilide，但都沒有顯色，就是說沒有酶活。難道對這些位點都不切割嗎？有沒有可能有其他原因？合成小肽的長度對酶特異性影響大嗎？另外，有一些底物是用dmso溶解的，我的酶不耐有機溶劑，但底物只占終體積的1/10,dmso會對我的酶產(chǎn)生影響嗎？謝謝！答：合成小肽的長度對酶活
蛋白酶活性與PH值的關(guān)系 2010/01/20
蛋白酶活性與PH值的關(guān)系問：要抑制蛋白酶對細胞外基質(zhì)的酶解作用，我想請教一下，在PH7-8之間蛋白酶的活性能夠被明顯的抑制嘛？因為PMSF毒性太大，還有沒有別的抑制蛋白酶活性的試劑阿？EDTA能夠抑制金屬蛋白酶嘛？是不是跟EDTA螯合了Mg，Ca有關(guān)？答：許多細胞蛋白酶只有在溶酶體的偏酸性環(huán)境中才具有zui大的活性，將pH調(diào)制中性將有助于使蛋白酶的活性降至zui低，但是仍然不能*消除它的影響，目前zui常用的方法是通過加入蛋白酶抑制劑控制蛋白酶水解，同時盡可能在4度下進行操作。PMSF毒性確實很
植物病毒病檢測方法2010/01/20
植物病毒病檢測方法植物病毒病是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上一種重要病害，嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量,目前還沒有1種治療效果較理想的藥劑，對發(fā)病植株做到早期診斷及提前檢測就顯得尤為重要。植物病毒學(xué)歷經(jīng)近百年的發(fā)展，植物病毒的檢測方法與手段也在不斷發(fā)展與改進。常用的方法有侵染力測定法、血清學(xué)方法、電子顯微鏡計數(shù)和分子生物學(xué)法等。1.4.1侵染力測定法侵染力測定法是將病毒樣本接種在植物上，根據(jù)侵染力的大小定量。它的靈敏度在所有定量法中是比較高的，而且是其他定量法的基礎(chǔ)。設(shè)計一種新的定量法，如果不經(jīng)過侵染力的驗證，將無法
常用酶的配制2010/01/19
常用酶的配制1．溶菌酶用水配制成50mg/ml的溶菌酶溶液，分裝成小份并保存于-20℃。每一小份一經(jīng)使用后便予丟棄。2．蛋白水解酶類貯存液貯存溫度反應(yīng)濃度反應(yīng)緩沖液溫度預(yù)處理0.01mol/LTris（pH7.8）鏈霉蛋白酶a20mg/ml-20℃（溶于水）1mg/ml0.01mol/LEDTA37℃自消化b0.5%SDS0.01mol/LTris（pH7.8）蛋白酶Kc20mg/ml-20℃（溶于水）50μg/ml0.005mol/LEDTA37～56℃無須預(yù)處理0.5%SDSa：鏈霉蛋白酶是
試劑配制注意事項2010/01/19
試劑配制不同的培養(yǎng)液在配制的時候其成分不同，要注意的事項也不同。一、配制首先要保證每種成分都是合格的。1水的質(zhì)量很關(guān)鍵，zui少是三蒸，電阻率在0.1-1.0×10-6Ω?cm以上。2血清等其它營養(yǎng)成分注意看是否在保質(zhì)期。二、配制時各成分是分開來配，用之前混好，一周之內(nèi)用完。2zui基本的成分配好過濾分裝放置4度。3血清用之前再按比例加入。4抗生素也分裝保存，用之前加入。5如果配方要求加谷氨酰胺，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應(yīng)置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培養(yǎng)液內(nèi)。已含谷氨酰胺的培養(yǎng)液在
PCR實驗污染與對策2010/01/19
PCR反應(yīng)的zui大特點是具有較大擴增能力與*的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生.一、污染原因1、標(biāo)本間交叉污染:標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;標(biāo)本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導(dǎo)致彼此間的污染.2、PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染
流式細胞儀2010/01/19
流式細胞儀介紹流式細胞儀就是進行流式細胞分析的儀器，它集電子技術(shù)、計算機技術(shù)、激光技術(shù)、流體理論于一體，是一種非常先進的檢測儀器，被譽為試驗室的“CT”。流式細胞術(shù)（FlowCytoMeter,FCM）是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段，它可以高速分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中測得多個參數(shù)，與傳統(tǒng)的熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點，成為當(dāng)代的細胞定量分析技術(shù)。工作原理將待測細胞染色后制成單細胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓入流動室，不含細胞
羅氏公司TUNEL細胞凋亡檢測程序2010/01/19
羅氏公司TUNEL細胞凋亡檢測程序貨號：11684817910，InSituCellDeathDetectionKit,POD，價格：5266.8一、原理：TUNEL（TdT-mediateddUTPnickendlabeling）細胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況。其原理是熒光素（fluorescein）標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdTEnzyme）的作用下，可以連接到凋亡細胞中斷裂DNA的3’-OH末端，并與連接辣根過氧化酶（HRP，h
如何保存抗體2010/01/19
如何保存抗體抗體保存得當(dāng)與否，直接決定了抗體的活性和使用效果！如果抗體保存得當(dāng)，大部分抗體活性都可以維持?jǐn)?shù)月甚至數(shù)年。請謹(jǐn)記！無論何時請按照說明書推薦的保存條件正確保存抗體！1.收到抗體后請務(wù)必在12000rpm離心1-5分鐘后再打開管蓋進行分裝和保存（如果抗體體積小于50ul，請延長離心時間至5分鐘，以保證全部抗體均離心下來）！2.比較合適的保存方式是分裝后保存在-20℃or-80℃。對絕大多數(shù)抗體來說，保存在-20℃是*足夠了。沒有任何證據(jù)顯示保存在-80℃會有更多的好處！分裝可以zui大程
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