培安有限公司
【CEM】環(huán)狀二硫鍵橋肽的全自動(dòng)合成
檢測樣品:環(huán)狀二硫鍵橋肽
檢測項(xiàng)目:合成
方案概述:采用先進(jìn)的全自動(dòng)快速合成技術(shù),我們不僅成功且高效地完成了含二硫鍵橋接的環(huán)肽的合成,同時(shí)確保了產(chǎn)物的高純度。借助CarboMAX化學(xué)技術(shù)的優(yōu)良性能,偶聯(lián)效率得到了顯著提升,這不僅極大縮短了合成時(shí)間,還確保了產(chǎn)物的高純度。
一、引言
含有二硫鍵的環(huán)肽代表了一類具有廣泛生物功能的化合物,其功能范圍從毒素到重要的激素。1二硫鍵有助于穩(wěn)定肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象,這有利于提高蛋白水解穩(wěn)定性和目標(biāo)親和力。2由于它們具有潛在的治療價(jià)值,對合成含二硫鍵橋連的環(huán)肽的興趣穩(wěn)步增長。通過使用正交保護(hù)的半胱氨酸氨基酸,如Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH和Fmoc-(S)-Cys(STmp)-OH(圖1),可以制備含有二硫鍵的肽。Cys(Mmt)基團(tuán)可以使用稀釋的三氟乙酉夋(TFA)溶液選擇性去保護(hù),而Cys(STmp)基團(tuán)則使用二硫蘇糖醇(DTT)作為還原劑進(jìn)行正交去保護(hù)。去保護(hù)后,使用N-氯琥珀酰亞胺(NCS)作為溫和氧化劑,可以選擇性氧化Cys巰基形成二硫鍵。3
在這里,我們報(bào)告了使用Liberty BlueTM微波肽合成器全自動(dòng)合成良好純度的含二硫鍵橋連的環(huán)肽。一個(gè)骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體激活素樣激酶3 (Alk3)的肽激動(dòng)劑THR-1234,在3小時(shí)內(nèi)完成合成,純度為77%。最后,一種含有兩個(gè)二硫鍵的錐蝸牛毒素肽(Conotoxin-SI)5在不到4小時(shí)內(nèi)合成,純度為67%。將微波能量應(yīng)用于二硫鍵橋連肽的合成可以實(shí)現(xiàn)更高效的偶聯(lián),從而快速合成并達(dá)到高純度(CarboMAXTM)。6
圖1. 左:Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH;右:Fmoc-(S)-Cys(STmp)-OH
二、實(shí)驗(yàn)部分
HE-SPPS材料和方法:所有肽都是在CEM Liberty Blue™自動(dòng)微波肽合成器上合成的,使用的是Rink Amide ProTide™ LL樹脂(0.19 mmol/g替換)或Cl-MPA ProTide™ LL樹脂(0.18 mmol/g替換)。使用DMF進(jìn)行后去保護(hù)洗滌,然后采用DIC/Oxyma活化方法進(jìn)行偶聯(lián)。肽樹脂在CEM Razor®肽裂解系統(tǒng)上用TFA/TIS/H2O/DODT(92.5/2.5/2.5/2.5)裂解。肽在冷乙酉迷中沉淀,粗品在分析前進(jìn)行凍干。
分析:粗肽在配備了Acquity UPLC BEH C8柱(1.7 μm, 2.1 x 100 mm)的Waters Acquity UPLC系統(tǒng)上進(jìn)行分析,該系統(tǒng)裝有PDA檢測器。UPLC系統(tǒng)連接到Waters 2100單四級(jí)桿MS用于結(jié)構(gòu)測定。峰分析是在Waters MassLynx軟件上完成的。分離是通過(i)水中的0.05% TFA和(ii)乙腈中0.05% TFA的梯度洗脫進(jìn)行的。
三、結(jié)果和討論
A)合成THR-123,CYFDDSSNVLCKKYRS-CO2H
選擇THR-123(圖2)來展示含有C端酸的單一二硫鍵橋連肽的合成。該肽在10 µmol規(guī)模上使用Cl-MPA ProTide™ LL樹脂(0.18 mmol/g替換)進(jìn)行合成。第一個(gè)氨基酸使用CEM之前報(bào)道的氯化物加載循環(huán)自動(dòng)加載。所有其他氨基酸循環(huán)使用1分鐘/90ºC去保護(hù)和一次2分鐘/90ºC與DIC/Oxyma偶聯(lián)(使用Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH用于C)。使用2% TFA的DCM溶液進(jìn)行Cys(Mmt)的去保護(hù)。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1分鐘,重復(fù)五次。使用25 mM的NCS的DMF溶液實(shí)現(xiàn)二硫鍵的形成。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行15分鐘。在Liberty Blue自動(dòng)微波肽合成器上進(jìn)行的THR-123的微波增強(qiáng)SPPS產(chǎn)生了77%純度的目標(biāo)肽(圖3)。
圖2.THR-123
圖3. THR-123的UPLC色譜圖
B) 合成Conotoxin-SI,ICCNPACGPKYSC-NH2
選擇Conotoxin-SI(圖4)來展示含有兩個(gè)二硫鍵的環(huán)肽的合成。該肽在10 µmol規(guī)模上使用Rink Amide ProTide™ LL樹脂(0.19 mmol/g替換)進(jìn)行合成。所有氨基酸循環(huán)使用1分鐘/90ºC去保護(hù)和一次2分鐘/90ºC與DIC/Oxyma偶聯(lián)(使用Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH用于C;使用Fmoc-(S)-Cys(STmp)-OH用于C)。使用2% TFA的DCM溶液進(jìn)行Cys(Mmt)的去保護(hù)。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1分鐘,重復(fù)五次。使用25 mM的NCS的DMF溶液實(shí)現(xiàn)二硫鍵的形成。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行15分鐘。使用5% DTT + 0.1 M NMM的DMF溶液進(jìn)行Cys(STmp)的去保護(hù)。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行5分鐘,重復(fù)三次。最后,使用25 mM NCS的DMF溶液形成第二個(gè)二硫鍵(室溫下15分鐘)。在Liberty Blue自動(dòng)微波肽合成器上進(jìn)行的Conotoxin-SI的微波增強(qiáng)SPPS產(chǎn)生了67%純度的目標(biāo)肽(圖5)。
圖4.Conotoxin-S
圖5. Conotoxin-SI的UPLC色譜圖
四、結(jié)論
采用全自動(dòng)快速合成技術(shù),我們成功高效地完成了含二硫鍵橋接的環(huán)肽的合成,并且實(shí)現(xiàn)了較高的純度。借助CarboMAX™6化學(xué)技術(shù),偶聯(lián)效率得到了顯著提升,這不僅極大縮短了合成時(shí)間,還確保了產(chǎn)物的高純度。例如,一個(gè)C端帶有羧酸的環(huán)狀二硫鍵橋接肽——THR-123,在短短不到3小時(shí)的時(shí)間內(nèi)就被迅速合成出來,且純度達(dá)到了77%。相比之下,傳統(tǒng)的室溫合成方法通常需要長達(dá)20小時(shí)來合成包含兩個(gè)二硫鍵的Conotoxin-SI。3而利用微波增強(qiáng)的固相肽合成技術(shù)(SPPS),在不到4小時(shí)內(nèi)就制備出了純度為67%的相應(yīng)肽。
引用
1 Góngora-Benítez, M.; Tulla-Puche, J.; Albericio, F. Chem. Rev. 2014, 114 (2), 901–926.
2 Adessi, C.; Soto, C. Curr. Med. Chem. 2002, 9 (9), 963–978.
3 Postma, T. M.; Albericio, F. Org. Lett. 2013, 15 (3), 616–619.
4 Sugimoto, H.; LeBleu, V. S.; Bosukonda, D.; Keck, P.; Taduri, G.; Bechtel, W.; Okada, H.; Carlson, W.; Bey, P.; Rusckowski, M.; Tampe, B.; Tampe, D.; Kanasaki, K.; Zeisberg, M.; Kalluri, R.; Kalluri, R. Nat. Med. 2012, 18 (3), 396–404.
5 Azam, L.; McIntosh, J. M. Acta Pharmacol. Sin. 2009, 30 (6), 771–783.
6 CEM Application Note (AP0124) - “CarboMAX - Enhanced Peptide Coupling at Elevated Temperature.”
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