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上海北諾生物科技有限公司
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蛋白質(zhì)技術(shù)專題：血清蛋白瓊脂糖凝膠電泳2013/12/11
【原理】瓊脂糖（agarose）是經(jīng)過挑選，以質(zhì)地較純的瓊脂（agar）作為原料而制成的。瓊脂在化學(xué)上是由瓊脂糖和瓊脂膠組成的復(fù)合物。瓊脂膠是一含有硫酸根和羥基的多糖，它具有離子交換性質(zhì)，這種性質(zhì)會給電泳及凝膠過濾以不良的影響。瓊脂糖是直鏈多糖，它由D－半乳糖和3,6－脫水－L－半乳糖的殘基交替排列組成。瓊脂糖主要通過氫鍵而形成凝膠。電泳時(shí)因凝膠含水量大（98－99%），近似自由電泳，因?yàn)楣腆w支持物的影響少，故電泳速度快，區(qū)帶整齊。而且由于瓊脂糖不含帶電荷的基團(tuán)，電滲影響很少，是一種較好的電泳材
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：血漿游離血紅蛋白測定2013/12/05
實(shí)驗(yàn)原理血紅蛋白具有類過氧化物酶活性，可催化H2O2釋放新生態(tài)氧，使鄰甲聯(lián)苯胺氧化發(fā)生顏色變化，由無色zui終變?yōu)樗{(lán)紫色。根據(jù)顯色深淺與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，可測出其含量。實(shí)驗(yàn)方法材料：1．2g/L鄰甲聯(lián)苯胺溶液2．1%H2O23．10%醋酸溶液4．分光光度計(jì)方法：1.抽取靜脈血2-3ml，枸櫞酸鈉抗凝，離心分離血漿。2．按下表進(jìn)行操作，用分光光度計(jì)，波長為530nm，以空白管調(diào)零，測定測定管的吸光度。試劑（ml）測定管空白管2g/L鄰甲聯(lián)苯胺溶液0.50.5患者血漿0.02/1%H2O20.50.5混
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：血紅蛋白電泳（hemoglobin electrophoresis）2013/12/05
實(shí)驗(yàn)原理血紅蛋白電泳（hemoglobinelectrophoresis）目的是檢出和確認(rèn)各種正常和異常的血紅蛋白。根據(jù)不同的血紅蛋白帶有不同的電荷，等電點(diǎn)不同，在一定的pH緩沖液中，血紅蛋白的等電點(diǎn)小于緩沖液的pH時(shí)帶負(fù)電荷，電泳時(shí)在電場中向陽極泳動(dòng)，反之，Hb帶正電荷向陰極泳動(dòng)。在一定電壓下，經(jīng)過一定時(shí)間的電泳，不同的血紅蛋白所帶電荷不同，分子量不同，其泳動(dòng)方向和速度不同，可分離出各自的區(qū)帶，同時(shí)對電泳出的各區(qū)帶進(jìn)行比色或電泳掃描，可進(jìn)行各種血紅蛋白的定量分析。一般zui常用的是pH8.6醋
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測外源蛋白的表達(dá)2013/12/05
[實(shí)驗(yàn)原理]SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS—PAGE）是蛋白分析中zui經(jīng)常使用的一種方法。它是將蛋白樣品同離子型去垢劑十二烷基硫酸鈉（SDS）以及巰基乙醇一起加熱，使蛋白變性，多肽鏈內(nèi)部的和肽鏈之間的二硫鍵被還原，肽鏈被打開。打開的肽鏈靠疏水作用與SDS結(jié)合而帶負(fù)電荷，電泳時(shí)在電場作用下，肽鏈在凝膠中向正極遷移。不同的大小的肽鏈由于在遷移時(shí)受到的阻力不同，在遷移過程中逐漸分開，其相對遷移率與分子量的對數(shù)間成線形關(guān)系。pGLO是將綠色熒光蛋白（GFP）的基因克隆在阿拉伯糖啟動(dòng)子之后的一種表達(dá)
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定IgG純度2013/12/05
（一）原理由于聚丙烯酰胺凝膠的濃度可以按要求配制，因此可以形成“連續(xù)系統(tǒng)”和“不連續(xù)系統(tǒng)”兩種電泳系統(tǒng)?！安贿B續(xù)系統(tǒng)”zui大的特點(diǎn)在于大大提高了樣品分離的分辨率。這種電泳的主要特點(diǎn)是：（1）使用兩種不同濃度的凝膠系統(tǒng)；（2）配制兩種凝膠的緩沖溶液成分及pH不同，并且與電泳槽中電泳緩沖液的成分、pH也不相同。在實(shí)驗(yàn)中，電泳凝膠分為兩層：上層膠為低濃度的大孔膠，稱為濃縮膠或成層膠，配制此層膠的緩沖液是Tris-HCl，pH6.7；下層膠則是高濃度的小孔膠，稱為分離膠或電泳膠，成膠的緩沖液是Tris
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：蛋白質(zhì)抽取2013/12/05
蛋白質(zhì)在細(xì)菌中表現(xiàn)后，以反復(fù)的冷凍-解凍方法打破細(xì)胞，再用硫酸銨把蛋白質(zhì)沉淀下來，此步驟可以去除大部份核酸、多醣、脂質(zhì)等雜物。儀器用具：恒溫震蕩培養(yǎng)箱37℃；高速冷凍離心機(jī)及離心管（使用20,000rpm離心陀）使用高速離心機(jī)要注意：離心機(jī)及離心陀的溫度要預(yù)冷*，相對位置的兩只離心管要平衡好，離心陀轉(zhuǎn)速不能超過zui高速限；液態(tài)氮及冰筒；37℃溫水浴藥品試劑：轉(zhuǎn)型菌株pQG11/M15[pREP]單一菌落；LB/amp/kan及IPTG（1Mstock）；Lysisbuffer（50mMNa3P
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：folin—酚試劑法（lowry法）測蛋白質(zhì)含量2013/12/05
一、實(shí)驗(yàn)原理這種蛋白質(zhì)測定法是zui靈敏的方法之一。過去此法是應(yīng)用zui廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難（現(xiàn)在已可以訂購），近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：PPO粗酶液的純化2013/12/03
一、原理1.葡聚糖凝膠SephadexG-200凝膠柱層析利用大分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部zui先流出柱外，而小分子物質(zhì)進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，流速慢而zui后流出柱外，凝膠層析法能將不同分子大小的物質(zhì)分離開。（G-200能分離800-80000D分子量的蛋白質(zhì)）2.利用離子交換法，選取DEAE-陰離子纖維素DE52柱材料，因?yàn)镻PO是帶有陽離子的蛋白質(zhì)，在層析時(shí)會吸附在柱材料上，而雜蛋白會洗下。后用NaCl梯度洗脫P(yáng)PO，（NaCl為強(qiáng)離子交換劑，能將弱吸附在柱材料上的PPO置換下來）。粗酶液從而得到
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：蛋白質(zhì)測序2013/12/03
一、概念當(dāng)前，所謂蛋白質(zhì)測序，主要指的是蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的測定。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（Primarystructure）包括組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目。很多場合多肽和蛋白質(zhì)可以等同使用。多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)氨基酸順序的測定是蛋白質(zhì)化學(xué)研究的基礎(chǔ)。自從1953年F.Sanger測定了胰島素的一級結(jié)構(gòu)以來，現(xiàn)在已經(jīng)知道約十萬個(gè)不同蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。二、測定步驟1多肽鏈的拆分。由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進(jìn)行拆分。幾條多肽鏈借助非共價(jià)鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，如，血
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：免疫球蛋白提取技術(shù)2013/12/03
免疫球蛋白（ImmunoglobulinIg）的含量代表著機(jī)體體液免疫的水平，并進(jìn)一步代表著B細(xì)胞的功能，因此測定血清Ig含量可以推知機(jī)體的體液免疫功能和診斷某些疾病引起的Ig的過高和過低。隨著免疫學(xué)的發(fā)展和需要，免疫球蛋白的純化和其成分的提純成為*的手段。純化的方法很多，有單一法，但大多數(shù)采用二步法以上相結(jié)合的方法，特別是以硫酸銨提純?yōu)榛A(chǔ)，再經(jīng)過層析柱的方法來提高免疫球蛋白及其各成分的純度zui為常用。硫酸銨溶液能使蛋白質(zhì)膠體脫水并中和其電荷而使之沉淀下來（稱為鹽析）。不同濃度的硫酸銨鹽析蛋
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：蛋白質(zhì)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)2013/12/03
[原理]蛋白質(zhì)在十二烷基硫酸鈉（SDS）和巰基乙醇的作用下，分子中的二硫鍵還原，氫鍵等打開，形成按1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)比例的SDS-蛋白質(zhì)多肽復(fù)合物，該復(fù)合物帶負(fù)電，故可在聚丙烯酰胺凝膠電泳中向正極遷移，且主要由于凝膠的分子篩作用，遷移速率與蛋白質(zhì)的分子量大小有關(guān)，因此可以濃縮和分離蛋白質(zhì)多肽。聚丙烯酰凝膠電泳分離蛋白質(zhì)多數(shù)采用一種不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)，主要分為較低濃度的成層膠和較高濃度的分離膠，配制凝膠的緩沖液，其pH值和離子強(qiáng)度也相應(yīng)不同，故電泳時(shí)，樣品中的SDS-多肽復(fù)合物沿移動(dòng)的界面移
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：蛋白質(zhì)純化膠體過濾法2013/12/03
不同大小的蛋白質(zhì)分子進(jìn)入膠體過濾管柱，可依其分子量差異分離；是一種廣泛應(yīng)用的partition色析法（Pharmacia操作手冊，GelFiltration）。儀器設(shè)備：色析管柱（PharmaciaCcolumn,1.6×100cm）、鐵架、鐵夾及水平儀；部分收集器（fractioncollector,需準(zhǔn)備干凈試管約100支）；濃縮用離心機(jī)（低速5,000rpm）；濃縮用離心管Centriprep-30（Amicon4322）請注意其使用方法藥品試劑：膠體SephacrylS-300（Phar
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：液相色譜之反相液相色譜2013/11/27
反相色譜（reversedphascchromatography,RPC）是基于溶質(zhì)、極性流動(dòng)相和非極性固定相表面間的疏水效應(yīng)建立的一種色譜模式，任何一種有機(jī)分子的結(jié)構(gòu)中都有非極性的疏水部分，這部分越大，一般保留值越高，在液相色譜中這是應(yīng)用面zui廣的一種分離模式，在生物大分子的反相液相色譜條件下，流動(dòng)相多采用酸性的、低離子強(qiáng)度的水溶液，并加一定比例的能與水互溶的異丙醇、乙腈或甲醇等有機(jī)改性劑，大量使用的填料為孔徑在30納米以上的硅膠烷基鍵合相，除此之外，也有少量高聚物微球。實(shí)驗(yàn)表明，烷基鏈長對
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（Marker）知識匯總2013/11/27
相關(guān)專題蛋白Marker可分為：一、未預(yù)染的Marker即寬分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)、高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)以及低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn);二、預(yù)染的Marker即單色預(yù)染和多色預(yù)染。在westernblot過程中，分子量Marker就像個(gè)螺絲釘一樣沒雖然是個(gè)小細(xì)節(jié)，然而就是這樣一個(gè)小細(xì)節(jié)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有著不可忽視的作用。這個(gè)WesternBlot參照家族的一員的作用主要是用來指示蛋白條帶所對應(yīng)的分子量大小，只有標(biāo)準(zhǔn)量無誤了，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才有說服力，除此之外，蛋白標(biāo)準(zhǔn)還有表示轉(zhuǎn)移成功或者蛋白在凝膠上的電泳程度等等的作用，所以選擇
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：重組DNA技術(shù)與基因工程（組圖）2013/11/27
重組DNA技術(shù)是現(xiàn)代分子生物技術(shù)發(fā)展中zui重要的成就之一。即是基因工程（GeneEngineering）的核心技術(shù)。重組DNA技術(shù)（RecombinantDNATechnique）是人類根據(jù)需要選擇目的基因（DNA段）在體外與基因運(yùn)載體重組，轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞或生物體內(nèi)，以達(dá)到改良和創(chuàng)造新的物種和治療人類疾病的目的。這一技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，關(guān)鍵在于限制酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。一、限制酶限制性內(nèi)切核酸酶（restrictiveendonucleases），又稱限制酶。是特異性地切斷DNA鏈中磷酸二酯鍵的核酸酶
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：凝膠層析法脫鹽和分離蛋白質(zhì)2013/11/27
（一）原理凡鹽析所獲得的粗制蛋白質(zhì)（鹽析得到的IgG）中均含有硫酸銨等鹽類，這類將影響以后的純化，所以純化前均應(yīng)除去，此過程稱為“脫鹽”（desalthing）。脫鹽常用透析法和凝膠過濾法，這兩種方法各有利弊。前者的優(yōu)點(diǎn)是透析后析品終體積較小，但所需時(shí)間較長，且鹽不易除盡；凝膠過濾法則能將鹽除盡，所需時(shí)間也短，但其凝膠過濾后樣品體積較大。所以，要根據(jù)具體情況選擇使用。前實(shí)驗(yàn)中樣品體積較小，凝膠達(dá)濾后樣品體積不會太增加，所以選用凝膠過濾法。（二）試劑與器材（1）SephadexG-25。（2）0.
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：蛋白質(zhì)凝膠電泳凝膠的制備2013/11/27
【材料與試劑】（1）30%的丙烯酰胺：分別稱取29g丙烯酰胺，1gN,N-亞甲雙丙烯酰胺加溫?zé)岬娜ルx子水60ml，加熱至37℃溶解，補(bǔ)加水至終體積為100ml,過濾，即配成30%（w/v）丙烯酰胺貯存溶液。丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在貯存過程中緩慢轉(zhuǎn)變?yōu)楸┧岷碗p丙烯酸，這一脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化，故溶液的pH值不超過7.0，應(yīng)置于棕色瓶中4℃保存。（2）10%十二烷基硫酸鈉（SDS）：稱取10gSDS加去離子水90ml加熱至68℃，加幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)至pH7.2加水至100ml，即為10%（w/v
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：雙向電泳操作步驟2013/11/27
水化上樣（被動(dòng)上樣）1.從冰箱中取出IPG膠條，室溫放置10min。2.沿水化盤槽的邊緣從左向右線性加入樣品，槽兩端各1cm左右不加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產(chǎn)生氣泡，否則會影響膠條中蛋白質(zhì)的分布。3.用鑷子輕輕撕去IPG膠條上的保護(hù)層。注意：堿性端較脆弱，應(yīng)小心操作。4.將IPG膠條膠面朝下輕輕置于水化盤中樣品溶液上。注意：不要將樣品溶液弄到膠條背面，因?yàn)檫@些溶液不會被膠條吸收；還使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡。如產(chǎn)生了氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動(dòng)膠條，直到氣泡被趕走。5.
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：免疫共沉淀（Co-IP）詳細(xì)步驟教程2013/11/25
一、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。目前多用精制的proreinA預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的pror
蛋白質(zhì)技術(shù)專題：蛋白質(zhì)的表達(dá)、分離和純化2013/11/25
目的要求（1）了解克隆基因表達(dá)的方法和意義。（2）了解重組蛋白親和層析分離純化的方法。實(shí)驗(yàn)原理克隆基因在細(xì)胞中表達(dá)對理論研究和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用都具有重要的意義。通過表達(dá)能探索和研究基因的功能以及基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理，同時(shí)克隆基因表達(dá)出所編碼的蛋白質(zhì)可供作結(jié)構(gòu)與功能的研究。大腸桿菌是目前應(yīng)用zui廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，其表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其它基因表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的目的蛋白量甚至能超過細(xì)菌總蛋白量的80%。本實(shí)驗(yàn)中，攜帶有目標(biāo)蛋白基因的質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中，在37℃，IPTG誘導(dǎo)下，超量表達(dá)攜帶有
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