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上海北諾生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第14年
感受態(tài)專題：感受態(tài)細(xì)胞的制備及溶液配制2013/11/11
實(shí)驗(yàn)試劑LB培養(yǎng)基，KB培養(yǎng)基，10%甘油，液氮，0.1MCaC12溶液實(shí)驗(yàn)設(shè)備超凈工作臺(tái)，搖床，離心機(jī)，250mL離心瓶，0.5mL的離心管實(shí)驗(yàn)材料大腸桿菌，農(nóng)桿菌和假單胞桿菌實(shí)驗(yàn)步驟1.電擊感受態(tài)細(xì)胞的制備1）-80℃保存的大腸桿菌，農(nóng)桿菌或者假單胞桿菌在固體平板上（DH，BL21在LB平板上，GV3101在LB/Gen;P.s.pv.tomato0288-9和P.syringaepv.tabaci6505在KB平板上）劃線。2）接種單克隆于5-10mL液體培養(yǎng)基，37℃（大腸桿菌）或者28
感受態(tài)專題：真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟2013/11/11
1.在6孔板中接種1~3×105細(xì)胞/孔，加入2ml*培養(yǎng)基，置CO2孵箱中37℃培養(yǎng)過。2.待細(xì)胞長(zhǎng)到50-80%單層時(shí)，在無菌離心管中配制如下溶液：i.溶液A：將4?g待轉(zhuǎn)染的超純DNA稀釋到250?l無血清培養(yǎng)基中，靜置5minii.溶液B：將2-25?lLipofectAMINE稀釋到250?l無血清培養(yǎng)基中，靜置5min3.混合溶液A和B，輕輕混勻，室溫放置15-45min。4.用2ml無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌細(xì)胞，加入0.8ml無血清培養(yǎng)基/孔，將脂質(zhì)體復(fù)合物滴加到孔中，輕輕搖晃混勻，置
感受態(tài)專題：轉(zhuǎn)化克隆的篩選和鑒定2013/11/11
1．目的學(xué)會(huì)用酶切法或PCR法篩選重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功的克隆菌。2．原理利用轉(zhuǎn)化后宿主菌所獲得的抗菌素抗性性狀篩選出獲得質(zhì)粒的菌落克隆。再?gòu)倪@些菌落中鑒定出質(zhì)粒上帶有外源基因插入片斷的克隆菌落。3．器材旋渦混合器，小鑷子，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml微量離心管，雙面微量離心管架，干式恒溫氣浴（或恒溫水浴鍋），制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，超凈工作臺(tái)，酒精燈，無菌牙簽，搖菌管。4．試劑LB培養(yǎng)基（加抗菌素），PCR用試劑，引物，質(zhì)粒提取用試劑，酶切需要的限制性內(nèi)且酶及其緩沖液，65%甘油（65%甘油，0
感受態(tài)專題：細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染2013/11/06
原理：通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法及電穿孔等基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將靶基因?qū)爰?xì)胞，一般在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)左右，靶基因即可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?8小時(shí)后即可進(jìn)行靶基因表達(dá)的檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用：觀察目的基因及其表達(dá)蛋白在某種細(xì)胞中的功能（短時(shí)間即可進(jìn)行觀察，但效應(yīng)會(huì)很快丟失）。一般流程：1）細(xì)胞接種：轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前天接種細(xì)胞，各種細(xì)胞的平板密度依據(jù)各種細(xì)胞的生長(zhǎng)率和細(xì)胞形狀而定。進(jìn)行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞密度應(yīng)達(dá)到60%~80%覆蓋。2）細(xì)胞轉(zhuǎn)染（脂質(zhì)體、電穿孔、FuGENE6等）3）48小時(shí)以后鑒定目的基因的表達(dá)情
感受態(tài)專題：電轉(zhuǎn)化流程2013/11/06
一、電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備1.用槍頭挑取單克隆菌落，投入盛有10mlLB液體培養(yǎng)基的50ml離心管中。（同時(shí)做培養(yǎng)基和槍頭的空白對(duì)照）2.37℃，220rpm，培養(yǎng)14-16個(gè)小時(shí)。3.第二天，以1：100的比例將這10ml菌液倒入1000mlLB液體培養(yǎng)基中，37度，220rpm，振搖2-3小時(shí)，每半小時(shí)測(cè)一次OD，當(dāng)OD值達(dá)到0.3-0.4時(shí)，停止培養(yǎng)。4.將菌液在冰上預(yù)冷30分鐘，隨后將菌液分裝到500ml預(yù)冷的離心杯中，4℃，2500rpm離心10分鐘。5.棄上清，離心杯中加入少量ddH
感受態(tài)專題：電穿孔轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli TG1細(xì)胞的制備2013/11/06
材料和試劑1.恒溫旋轉(zhuǎn)式搖床2.三角燒瓶（容量為1或2L）3.50ml滅菌離心管4.低溫高速離心機(jī)5.SB培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨20g細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5gNaCl0.5g去離子水950ml250mmol/LKCl溶液10ml以5N的NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.0，加去離子水至1L，高壓蒸氣滅菌。6.20%葡萄糖溶液7.1mol/LMgCl2溶液8.10%甘油操作步驟1.從新鮮的LB平板培養(yǎng)物中挑選一個(gè)TG1克隆，接種于10m1SB培養(yǎng)基中。2.37℃搖床培養(yǎng)過。3.取2.5ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)
感受態(tài)專題：磷酸鈣法轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞2013/11/06
一.試劑配制無菌水ddw：高溫滅菌；分裝；2XHBS：280mMNaCl10mMKCl1.5mMNa2HPO412mMglucose50mMHEPESAdjustthepH,every0.05pHfrom7.00to7.45using10NNaOH,thenaddddw.tothefinalvolume.過濾滅菌，分裝；2MCaCl2：過濾滅菌，分裝。二.實(shí)驗(yàn)過程：1.鋪細(xì)胞：選擇狀態(tài)良好的293T細(xì)胞傳代，2-3x105個(gè)細(xì)胞/35mmdish。2.20-24h后，待細(xì)胞長(zhǎng)至鋪滿瓶底約50-7
專題：原核表達(dá)（原理、材料與實(shí)驗(yàn)方案）2013/11/06
一、原理1、E.coli表達(dá)系統(tǒng)E.coli是重要的原核表達(dá)體系。在重組基因轉(zhuǎn)化入E.coli菌株以后，通過溫度的控制，誘導(dǎo)其在宿主菌內(nèi)表達(dá)目的蛋白質(zhì)，將表達(dá)樣品進(jìn)行SDS-PAGE以檢測(cè)表達(dá)蛋白質(zhì)。2、外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)提高外源基因表達(dá)水平的基本手段之一，就是將宿主菌的生長(zhǎng)與外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段，以減輕宿主菌的負(fù)荷。常用的有溫度誘導(dǎo)和藥物誘導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)采用異丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。不同的表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)方法并不*相同，因啟動(dòng)子不同，誘導(dǎo)表達(dá)要根據(jù)具體情況而定。二
感受態(tài)制備：農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)2013/10/30
農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)標(biāo)簽：農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備植物轉(zhuǎn)基因農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備可以：（1）用于建立農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系；（2）用于農(nóng)桿菌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建；（3）用于農(nóng)桿菌其他分子生物學(xué)研究。實(shí)驗(yàn)方法氯化鈣法電轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌感受態(tài)實(shí)驗(yàn)方法原理在基因工程操作中，感受態(tài)細(xì)胞的制備和質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化是一項(xiàng)基本技術(shù)。感受態(tài)是細(xì)菌細(xì)胞具有的能夠接受外源DNA的一種特殊生理狀態(tài)。農(nóng)桿菌的感受態(tài)可用CaCl2處理而誘導(dǎo)產(chǎn)生。將正在生長(zhǎng)的農(nóng)桿菌細(xì)胞加入到低滲的CaCl2溶液中，0℃下處理便會(huì)使細(xì)菌細(xì)胞膜的透性發(fā)生改變，此時(shí)的細(xì)胞呈現(xiàn)
感受態(tài)制備：農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化2013/10/30
雙元載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化1.1農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備1.1.1.取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml鏈霉素平板劃線，28℃培養(yǎng)。1.1.2.挑取單菌落接種于5mlYM液體培養(yǎng)基中，220rpm28℃振蕩培養(yǎng)12-16hr。1.1.3.取2ml菌液轉(zhuǎn)接于100mlYM液體培養(yǎng)基中，28℃220rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5。1.1.4.轉(zhuǎn)入無菌離心管，5000rpm離心5min,去上清液。1.1.5.加入10ml預(yù)冷的0.1M的CaCl2溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置20min。4℃500
感受態(tài)制備：酵母感受態(tài)細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)2013/10/30
標(biāo)簽：酵母感受態(tài)細(xì)胞制備酵母感受態(tài)細(xì)胞制備可以：（1）用于建立酵母轉(zhuǎn)化體系；（2）用于酵母表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建；（3）用于酵母其他分子生物學(xué)研究。實(shí)驗(yàn)方法化學(xué)法試劑盒制備法實(shí)驗(yàn)材料釀酒酵母試劑、試劑盒YPDA液體培養(yǎng)基蒸餾水甘油二甲基亞砜?jī)x器、耗材培養(yǎng)皿離心機(jī)離心管冰箱實(shí)驗(yàn)步驟一、試劑與耗材1.試劑細(xì)菌用-酵母提取物（Fisher）、細(xì)菌用-蛋白胨（Fisher）、葡萄糖（Fisher）、細(xì)菌用-瓊脂粉、去離子水、甘油（Sigma）、二甲基亞砜（Sigma）、聚乙二醇3350（Sigma）、醋酸鋰（Si
感受態(tài)制備：枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)2013/10/30
標(biāo)簽：枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備可以：（1）用于建立枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化體系；（2）用于其基因改造；（3）用于提高枯草芽孢桿菌生產(chǎn)性能相關(guān)研究。實(shí)驗(yàn)方法化學(xué)法化學(xué)改進(jìn)法實(shí)驗(yàn)材料枯草芽孢桿菌168試劑、試劑盒SPI培養(yǎng)基EGTASPII培養(yǎng)基檸檬酸鈉EGTA氫氧化鈉KH2PO4K2HPO4MgCl2MgSO4葡萄糖酵母膏（NH4）2SO4儀器、耗材培養(yǎng)箱培養(yǎng)皿錐形瓶紫外分光光度計(jì)接種環(huán)離心管實(shí)驗(yàn)步驟一、試劑配制1.SP鹽0.2%（NH4）2SO4，1.4%K2HPO4，0.
細(xì)胞轉(zhuǎn)染：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的幾個(gè)實(shí)驗(yàn)方法2013/10/30
摘要：本實(shí)驗(yàn)介紹了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的幾個(gè)方法。實(shí)驗(yàn)原理脂質(zhì)體（LR）試劑是陽離子脂質(zhì)體DOTMA和DOPE的混合物（1：1）。它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前條件下zui方面的轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞。用LR進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，首先需要優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，應(yīng)找出該批LR對(duì)轉(zhuǎn)染某一特定細(xì)胞適合的用量、作用時(shí)間等，對(duì)每批LR都要做。先要固定一個(gè)DNA的量和DNA/LR混合物與細(xì)胞相互作用的時(shí)間，DNA可從1-5ug和孵育時(shí)間6h，開始，
細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)2013/10/30
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的主要方法——脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。了解外源基因進(jìn)入的一般性方法，觀測(cè)外源蛋白的表達(dá)（綠色熒光蛋白），為染色準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料。二、實(shí)驗(yàn)原理上圖所示是脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的示意圖，它顯示了外源質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞的一般過程。外源基因進(jìn)入細(xì)胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法。電擊法是在細(xì)胞上短時(shí)間暫時(shí)性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入；磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進(jìn)入細(xì)胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染
感受態(tài)制備：大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備、重組DNA的轉(zhuǎn)化、克隆篩選2013/10/30
1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵笸ㄟ^本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞的技術(shù)以及篩選轉(zhuǎn)化體的技術(shù)。了解細(xì)胞轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中的意義。2.相關(guān)知識(shí)及原理感受態(tài)細(xì)胞（Competentcells）：受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許多有外源DNA的載體分子通過的感受態(tài)細(xì)胞（competentcell）。轉(zhuǎn)化（transformation）：是將異源DNA分子引入一細(xì)胞株系，使受體細(xì)胞獲得新的
RNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：核糖核酸酶保護(hù)分析2013/10/22
一、體外轉(zhuǎn)錄在無菌1.5ml微型離心管中，結(jié)合以下內(nèi)容：4ul5倍轉(zhuǎn)錄緩沖液2ul0.1MDTT4ul2.5MMNTP（A，C，G）0.8ulRNA酶抑制劑（25U/ul）RNA酶抑制劑（Promega）中100UM冷UTP1ul/ugUL線性DNA模板5ul10UCI/ULP32UTP（800Ci/mmol）1ulRNA聚合酶SP6，T7或T3總體積?20ul。孵育1小時(shí)，37℃。2ul每個(gè)轉(zhuǎn)錄的DNA酶I，孵育20分鐘，37℃。二、探頭凈化凈化探頭使用QIAGEN公司的QIAquick核苷酸
RNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：細(xì)胞質(zhì)RNA提取實(shí)驗(yàn)2013/10/22
標(biāo)簽：細(xì)胞質(zhì)RNA由于RNA的種類來源很多，因而提取制備方法各異，一般有苯酚法，去污劑法和鹽酸胍法，其中苯酚法實(shí)驗(yàn)室zui常用。組織勻漿后用苯酚處理離心，RNA即溶于上層被酚飽和的水相中，向水相加冷乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出。此法較好除去DNA和蛋白質(zhì)，且獲得生物活性的RNA。實(shí)驗(yàn)方法基本方案實(shí)驗(yàn)材料RNA試劑、試劑盒PBS細(xì)胞裂解液SDS蛋白酶K酚氯仿異戊醇無水乙醇儀器、耗材離心機(jī)培養(yǎng)箱實(shí)驗(yàn)步驟1.對(duì)于單層培奍細(xì)胞（1）每10cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)的細(xì)胞，用冰冷PBS洗滌3次。（2）每次1ml
RNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：Northern blot實(shí)驗(yàn)2013/10/22
標(biāo)簽：NorthernblotNorthernblot是一種通過檢測(cè)RNA的表達(dá)水平來檢測(cè)基因表達(dá)的方法，通過northernblot的方法可以檢測(cè)到細(xì)胞在生長(zhǎng)發(fā)育特定階段或者脅迫或病理環(huán)境下特定基因表達(dá)情況。Northernblot首先通過電泳的方法將不同的RNA分子依據(jù)其分子量大小加以區(qū)分，然后通過與特定基因互補(bǔ)配對(duì)的探針雜交來檢測(cè)目的片段。實(shí)驗(yàn)方法Northernblot技術(shù)NorthernBlot實(shí)驗(yàn)方法原理Northernblot的基本概述是將RNA樣品通過變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，
RNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：RNA的變性瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)原理、材料和操作步驟2013/10/22
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)RNA瓊脂糖凝膠電泳的使用技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理RNA可以使用非變性或變性凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。在非變性電泳中，可以分離混合物中不同分子量的RNA分子，凡是無法確定分子量。只有在變性情況下，RNA分子*伸展，其泳動(dòng)率才與分子量成正比。判斷RNA提取物的完整性是進(jìn)行電泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的電泳圖譜應(yīng)可清晰看到18srRNA、28srRNA、5srRNA的三條帶，且28srRNA的亮度應(yīng)為18srRNA的兩倍。三、材料、試劑及器具1、材料總RNA提取物。2、試劑（1）0
RNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：RNAi實(shí)驗(yàn)原理與方法選擇2013/10/12
一、RNAi的分子機(jī)制通過生化和遺傳學(xué)研究表明，RNA干擾包括起始階段和效應(yīng)階段（inititationａndeffectorsteps）。在起始階段，加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長(zhǎng)的小分子干擾RNA片段（smallinterferingRNAs,siRNAs）。證據(jù)表明；一個(gè)稱為Dicer的酶，是RNaseIII家族中特異識(shí)別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNA
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